Émission de fluorescence induite par le laser (L.I.F.E.) comme nouvel outil non invasif pour la mesure in situ des biomarqueurs dans les habitats cryosphériques

L’objectif global de cette étude est de calibrer et de tester un nouveau dispositif qui peut être utilisé pour des mesures in situ des biomarqueurs dans les habitats cryosphériques. L’appareil est basé sur la technologie d’émission de fluorescence induite par laser, appelée LIFE. Les méthodes d’échantillonnage standard actuelles entraînent des impacts physiques sur l’échantillon en raison de l’extraction des carrières, de la désintégration des échantillons par écaillage et sciage, et du changement de température par la fonte.

Ces méthodes conduisent souvent à la falsification des conditions in situ. Par conséquent, une nouvelle méthodologie pour la détection in situ et la caractérisation de la vie microbienne est cruciale. Nous avons développé une nouvelle méthode non invasive et non destructive avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

L’application d’une technique d’émission de fluorescence induite par laser est basée sur le fait que les environnements supraglaciaires sont habités, entre autres, par des organismes phototropiques. Ces organismes peuvent être retracés par la détection de motifs fluorescents des pigments accessoires à base de porphyrine chlorophylle A et phycoerythrine qui sont excités par un laser bleu et vert respectivement. Le kit portable à double longueur d’onde pèse 4,5 kilogrammes et est utilisé sur un trépied en combinaison avec un ordinateur externe.

Le tube de lentille est dirigé vers le spécimen. Puis, un laser vert de cinq milliwatts frappe l’échantillon après avoir passé un séparant de faisceau polarisant qui redirige la lumière polarisée vers l’axe optique du spectromètre. Le spécimen présente une lumière fluorescente illustrée en rouge.

La moitié de la lumière collimée passe le séparant polarisant du faisceau et est focalisée à travers un filtre à longue passe qui supprime les signaux laser. Ensuite, le signal frappe une fente d’ouverture qui se compose de deux lames de rasoir réglables. Un prisme sépare spectralement une fine ligne d’orthogonal léger à l’ouverture de fente avant que le signal ne soit capté sur un capteur.

La procédure est répétée avec le laser bleu. Les données brutes sont transférées automatiquement sur un ordinateur portable qui est également utilisé pour l’opération logicielle. Il est divisé en trois sections principales.

L’ajustement de l’exposition se fait manuellement. Ici, la correction entre le temps d’exposition et l’intensité du signal est linéaire. Le champ de commentaires est utilisé pour la description d’un échantillon.

Dans la bonne section, les images brutes sont affichées dès que la mesure est terminée. Cette fonctionnalité est cruciale pour l’évaluation immédiate des données sur le terrain. Les zones rouges indiquent des pixels surexposés qui peuvent être évités en réduisant le temps d’exposition.

Les images brutes à échelle grise de 12 bits montrent un composant spatial en raison de la fente d’ouverture unidimensionnelle et d’une composante spectrale due au prisme devant le CCD. En réponse aux contraintes optiques, les images brutes sont déformées. Par conséquent, ils doivent être recadrés et déformés en appliquant un code qui reconnaît le degré de distorsion.

Ensuite, l’étalonnage de longueur d’onde se fait à l’aide du laser de 532 nanomètres. La lumière verte est produite par doublement de fréquence de 1064 nanomètres laser infrarouge. Les deux longueurs d’onde peuvent être détectées par le CCD et donc la position spectrale de chaque pixel peut être calculée en images déformées.

Ensuite, l’image est recadrée jusqu’à une plage de longueur d’onde donnée. Les valeurs grises de chaque pixel d’une ligne de pixels sélectionnée sont comptées et résumées. Une valeur grise peut varier de zéro à 255.

Après cela, chaque ligne de pixels représente un numéro. Dans ce graphique, les comptes de valeur grise de chaque ligne de pixels sont tracés par rapport aux coordonnées spatiales. Cela permet une discrimination spatiale quantitative de la chlorophylle et de la phycoerythrine simultanément dans l’échantillon.

En outre, les propriétés spectrales d’un échantillon peuvent être tracées à partir de lignes de pixels sélectionnées. La configuration sur le terrain est rapide et facile. Fixez l’instrument sur un trépied.

Attachez le tube de lentille à l’appareil. Fixez le câble USB Arduino et le câble de la caméra. Connectez l’ordinateur externe à l’instrument à l’aide d’un câble USB.

Ajustez les pattes du trépied d’une manière que le tube de lentille couvre le spécimen. Exécutez le logiciel, décrivez l’échantillon et démarrez une série de mesures. Pour l’étalonnage des pigments, préparez une série de lignes de dilution à partir d’une solution de stock telle qu’affichée.

La solution de stock de chlorophylle A doit être diluée avec de l’acétone et la dilution de la phycoerythrine est effectuée avec de l’eau stérile distillée. Quinze millilitres de chaque étape de dilution seront nécessaires plus tard. Protégez les pigments de la lumière en les enveloppant sous du papier d’aluminium.

Conserver la chlorophylle dans un congélateur et la phycoerythrine au réfrigérateur jusqu’à nouvel usage. Ensuite, construire un rack comme indiqué avec une différence de hauteur de 1,5 centimètres. Ajouter cinq millilitres de dilution concentrée la plus élevée dans un flacon en plastique poly-scintillation.

Ce volume équivaut à une colonne d’eau haute de 15 millimètres dans le flacon et mesure l’intensité de fluorescence. Ensuite, placez le flacon en position médiane de la grille et ajoutez encore cinq millilitres de la même solution. Répétez la procédure avec un autre cinq millilitres qui équivaut à 45 millimètres de hauteur de colonne.

Répétez la procédure avec toutes les étapes de dilution de la chlorophylle et de la phycoerythrine. La hauteur du rack et de la colonne joue un rôle important pour la mesure puisque la surface des liquides se trouve dans le point focal de l’instrument LIFE. Recueillir des échantillons de neige et de glace dans un glacier.

De plus, prélever des échantillons de tapis microbiens dans l’avant-champ du glacier. Dans cette étude, Midtre Lovenbreen, un glacier à proximité des installations de recherche de Ny-Alesund dans l’archipel de l’Extrême-Arctique du Svalbard a été choisi. Faire fondre les échantillons de neige et de glace et les filtrer sous vide sous les filtres GF/F.

Notez le volume filtré. Ensuite, mesurez les filtres avec le dispositif LIFE sur quatre zones aléatoires chacune en triplicates à l’aide du laser vert et bleu. Calculer la concentration globale de pigments en multipliant la densité de la zone avec la zone filtrée et le volume filtré.

Normaliser la concentration pigmentaire en un volume d’un litre. Mettez les filtres dans un flacon avec 30 millilitres d’acétone et conservez-les dans l’obscurité à quatre degrés centigrades pendant la nuit. Ensuite, prenez un flacon et placez-le sur la glace avant la sonication pendant deux minutes à 50% de puissance en mode continu.

Presser et retirer le filtre du flacon. Le filtre n’est plus nécessaire. Fixez le tube de Tygon à une seringue et retirez le mélange d’acétone d’extraction de chlorophylle du flacon.

Remplacez le tube Tygon par un porte-filtre GF5. Transférer la solution dans une cuvette à quartz. Après avoir calibré le spectromètre d’absorption de l’acétone, placez l’échantillon contenant de la cuvette dans le spectromètre et mesurez les caractéristiques d’absorption entre 400 et 750 nanomètres.

Ensuite, retirez la cuvette du spectromètre et ajoutez 200 microlitres de deux acides chlorhydriques molaires à l’échantillon. Ensuite, répétez la mesure d’absorption afin de mesurer la teneur en phéophytine de l’échantillon. L’effet de la mesure laser sur l’activité des communautés bactériennes n’est pas encore décrit en détail.

Par conséquent, l’effet a été étudié par l’intermédiaire de la production primaire et secondaire. Pour la production bactérienne, prendre cinq aliquots de notre tapis bactérien. Trois aliquots sont utilisés pour l’absorption de leucine étiquetée tritium et deux aliquots sont utilisés comme contrôles.

Inactivez les commandes avec du formaldéhyde. Ajouter de la leucine étiquetée tritium à tous les aliquots. Répétez cette procédure avec tous les échantillons.

Ici, la quantité d’échantillon requise est indiquée pour notre conception expérimentale. Ensuite, exposez le tapis bactérien avec le laser vert et bleu comme indiqué dans la configuration expérimentale. Ensuite, inactivez tous les échantillons qui n’ont pas encore été traités avec du formaldéhyde.

Transférer l’échantillon dans un cryovial et ajouter de l’acide trichloroacetic ou TCA. Centrifuger le flacon à 10 000 g pendant cinq minutes. Ajouter le liquide de scintillation et mettre le cryovial dans un flacon de poly-scintillation.

Analyser les échantillons à l’aide d’un compteur de scintillation liquide et calculer les taux d’absorption. Pour la photosynthèse, préparez cinq aliquots comme avant dont deux sont assombris. Ajouter le traceur radioactif NaH14 CO3 et incuber pendant quatre heures.

Après l’incubation, arrêter la réaction en enveloppant les échantillons dans du papier d’aluminium. Mesurer les désintégrations par minute par scintillation liquide comme décrit précédemment. Après avoir normalisé les données pendant une période d’exposition d’une seconde et une hauteur de colonne d’échantillon de 15 millimètres, la ligne d’étalonnage finale a été calculée à l’aide d’une régression poisson.

La corrélation entre la densité de la zone et le nombre de photons a un caractère linéaire. La pente de la courbe est de 81,04. Cela signifie qu’un taux de dénombrement des photons de 8 104 dans un échantillon exposé pendant une seconde équivaut à une densité de surface de 100 nanogrammes par centimètre carré de phycoerythrine.

L’écart type dans les échantillons concentrés plus élevés peut s’expliquer par un processus d’auto-absorption au sein de l’échantillon. La chlorophylle Une courbe d’étalonnage présente des caractéristiques similaires et a un caractère linéaire avec une pente de 8,94. Six échantillons de glace et de neige filtrés ont été mesurés à l’aide de l’instrument LIFE avant l’extraction de la chlorophylle et les mesures subséquentes du spectre d’absorption pour l’analyse de la teneur en chlorophylle.

Les échantillons sont commandés par leur teneur en chlorophylle acquise par la spectrométrie d’absorption. Les données LIFE montrent de petits écarts types qui suggèrent que le matériau sur le filtre a été distribué relativement également. L’instrument LIFE sous-estime la teneur en chlorophylle des trois premiers filtres.

Les trois derniers filtres, qui présentent une teneur inférieure en chlorophylle, sont surestimés par l’instrument LIFE. La raison de la disparité des données peut s’expliquer par l’épaisseur du gâteau filtre. Dans les gâteaux filtre minces, illustrés en orange, les signaux de faible fluorescence sont capturés en raison de faibles densités de surface des pigments.

Les signaux de chlorophylle A sont illustrés en rouge dans cette image brute. Toutes les zones grises de cette image brute indiquent que le filtre lui-même présente des signaux induits par laser après avoir passé le filtre à longue passe de 450 nanomètres. Le logiciel a correctement compté ce signal comme chlorophylle A fluorescence.

La teneur élevée en pigments a été sous-estimée parce que le laser ne pouvait pas induire la réponse de fluorescence dans les molécules de chlorophylle A dans les couches plus profondes du gâteau de filtre. L’expérience d’exposition au laser n’indique aucun effet significatif sur la productivité primaire et secondaire des tapis bactériens. Ni le temps d’exposition de cinq à 60 secondes ni l’intensité du laser allant de cinq à 50 milliwatts n’ont montré aucun effet sur les résultats de productivité.

Cela implique que les intensités et les temps d’exposition plus élevés nécessaires pour produire de meilleurs signaux ne nuiraient pas aux cellules. Quatre cryoconites ont été mesurées in situ et elles sont comparées à la solution standard de chlorophylle qui a été mesurée dans des conditions de laboratoire montrées en rouge. Les pics de fluorescence spectrale en bleu correspondaient au spectre standard de chlorophylle, fournissant ainsi le concept de mesures in situ.

Des mesures LIFE ont été effectuées sur des sols, des tapis bactériens, des biofilms et des cryoconites. Des mesures DE VIE des cryoconites avec une couche épaisse de sédiments sont possibles si la surface couverte de cryoconite dépasse 12,5 centimètres carrés. Ce type de cryoconite bloque la lumière parasite sous la glace.

Dans de fines couches cryoconites, les signaux de fluorescence sont enveloppés par la lumière ambiante. Par conséquent, les mesures LIFE des surfaces de glace nues ne sont pas possibles alors que tous les autres types d’échantillons peuvent être analysés par l’instrument LIFE. Les changements de température entraînent une meilleure disponibilité de l’eau liquide, ce qui se traduit par une activité biologique plus élevée sur les surfaces des glaciers.

En conséquence, la concentration de pigments peut augmenter. Il est crucial de surveiller ces changements et de prédire les scénarios futurs possibles et probables.