פרוטוקול זה מתאר את מערכת הדממה הכימית כדי לגרום לעיבוי חלבונים בטלומרים. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לגרום עיבויים על loci גנומי אחרים, והוא מתאים לבדיקת היווצרות ותפקוד של מעבים הקשורים כרומטין. שיטה זו מציעה רזולוציה זמנית הנדרשת להדמיית תאים חיים ושומרת על הפרדת פאזה באוכלוסיית התאים לבדיקות ביוכימיות.
כדי להתחיל, להמיס dimerizers ב- DMSO ב 10 מילימולר ולאחסן אותם בצינורות microcentrifuge פלסטיק במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לדלל aliquot של 10 מילימולר דימרייזר בהדמיה בינונית לריכוז מלאי של 10 micromolar ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. כאשר מוכן לשימוש, לדלל dimerizers לריכוז עבודה סופי של 100 nanomolar במדיום צמיחה או מדיום הדמיה.
זרע 10 עד התאים החמישיים במשקפי כיסוי עגולים בקוטר 12 מ"מ מצופים בפולי-D-ליסין בצלחת של שש בארות. לאחר מכן להעביר את התאים עם Halo-GFP-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDFR-SIM מוטציה plasmids ולחכות 24 עד 48 שעות לפני שתמשיך immunofluorescence. מוסיפים את 100 הדימרימרים הננומולרים מדוללים לתאים ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות.
לאחר הדגירה, תקן את התאים בתמיסת PBS המכילה 4%פורמלדהיד ו- 0.1%טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל לתאים. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. כיסוי לשטוף מחליק פעמיים עם 50 microliters של TBS-Tx ופעם אחת עם 50 microliters של חוצץ דילול נוגדנים.
לדגור כל פיסת כיסוי עם 50 microliters של אנטי PML ראשוני, אנטי SUMO-1, או נוגדן נגד SUMO-2 ו 3 בארבע מעלות צלזיוס בתא לח בן לילה. כיסוי לשטוף מחליק שלוש פעמים עם חוצץ דילול נוגדנים כדי להסיר נוגדן ראשי מאוגד, ולאחר מכן לדגור על התאים עם נוגדן משני במשך שעה אחת בקופסה כהה בטמפרטורת החדר. לאחר הכתם, לשטוף כיסוי מחליק שלוש פעמים עם TBS-Tx.
סמן שקופיות תווית על-ידי הוספת שני מיקרוליטרים של מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI, ולאחר מכן הפוך את פתקי הכיסוי והנח אותם על טיפת DAPI. שאפו נוזל נוסף מקצה החלקה. לאטום את המגלשה עם לק, לאפשר לו להתייבש, ולשטוף את החלק העליון של כיסוי להחליק עם מים.
מניחים את השקופיות במקפיא עד להדמיה. זרע 10 לתאים החמישיים על משקפי כיסוי עגולים 12 מ"מ מצופים פולי-D-ליסין בצלחת שש באר ולהעביר אותם עם Halo-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה plasmids. תקן את התאים עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף אותם ארבע פעמים עם PBS.
עבור IF-FISH, להכתים את התאים עם נוגדנים ראשוניים ומשניים refix אותם עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף אותם ארבע פעמים עם PBS ולייבש את כיסוי החלקות בסדרת אתנול. לדגור על פתקי הכיסוי עם 488 טלומר C-PNA בדיקה בחמישה microliters של פתרון הכלאה ב 75 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן לדגור את כיסוי מחליק לילה בתא לח בטמפרטורת החדר. לשטוף את כיסוי מחליק שלוש פעמים עם חוצץ לשטוף במשך שתי דקות לכל לשטוף בטמפרטורת החדר ולהרכיב אותם עם מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI במדיה הרכבה להדמיה.
להדמיה חיה, הר את החלקות הכיסוי בתאים מגנטיים על במה מחוממת בתא סביבתי, שמירה על התאים במיליליטר אחד של מדיום הדמיה ללא פנול אדום. הגדר את מנגנון המיקרוסקופ והבקרה הסביבתית כמתואר בכתב היד של הטקסט. אתר תאים עם אות GFP בהיר על הטלומרים ואות mCherry מפוזר בציטוסול.
מצא כ-20 תאים, שינון כל מיקום עם מידע XYZ והגדר פרמטרים להדמיה של זמן-זמן. השתמש בריווח של 0.5 מיקרומטרים עבור סך של שמונה מיקרומטרים ב- Z ומרווח זמן של חמש דקות למשך שעתיים עד ארבע שעות הן עבור ערוצי GFP והן עבור ערוצי mCherry. השתמש ב-30% מ-594 ננומטר וב-50% מעוצמת הכוח של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 200 אלפיות השנייה ורווח מצלמה של 300.
התחל הדמיה ולקחת לולאה חד פעמית כמו קדם עמעום. לאחר מכן השהו הדמיה, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מדיית הדמיה המכילה 15 מיקרוליטרים של דימרייזר 10 מיקרומולר לתא ההדמיה, דאגו לא לגעת בשלב, ולחדש את ההדמיה. כאשר אתה מוכן להפוך את הדממה, השהה הדמיה והוסף 0.5 מיליליטר של מדיית הדמיה המכילה שני מיקרוליטרים של TMP מלאי 100 מילימולר לתא ההדמיה.
המשך הדמיה של התאים במשך שעה עד שעתיים. להדמיה קבועה, השתמש באותה הגדרת מיקרוסקופ כמו הדמיה חיה, אך ללא חימום הבמה. אתר סביב 30 עד 50 תאים עם האות האדום כדי לבחור עבור תאים transfected.
לרכוש תמונות עם מרווח של 0.3 מיקרומטר עבור סך של שמונה מיקרומטר ב Z.Use 80% של 647 ננומטר, 80% של 561 ננומטר, ו 70% של עוצמת כוח 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 600 אלפיות השנייה ורווח מצלמה של 300. לוקליזציה טלומרית של SUMO זוהתה באמצעות דג DNA טלומר ואימונופלואורסצנטיות חלבון SUMO. תאים עם גיוס SIM מועשר SUMO-1 ו SUMO-2 ו-3 בהשוואה לתאים עם גיוס מוטציות SIM, מה שמצביע על כך שעמעום SIM גרם להעשרת SUMO בטלומרים תלוי באינטראקציות SUMO-SIM.
סרט לשגות זמן של TRF-1 ו- SIM לאחר דימרציה מוצג כאן. SIM גויס בהצלחה לטלומרים, וגם מוקדי ה-SIM וה-TRF-1 הפכו גדולים ובהירים יותר, כצפוי להיווצרות טיפות נוזליות ולצמיחה. בנוסף, היתוך של מוקדי TRF-1 נצפתה, מה שהוביל להתקבצות טלומר, כפי שמוצג במספר הטלומר המופחת ועוצמת הטלומר המוגברת לאורך זמן.
לעומת זאת, מוטציית SIM גויסה לטלומרים לאחר דימרציה, אך לא עורר היווצרות טיפה או קיבוץ טלומר, מה שמצביע על כך שהפרדת פאזה ואשכול טלומר מונעים על ידי אינטראקציות SUMO-SIM. היפוך הפרדת הפאזה ואשכול הטלומר נצפתה לאחר הוספת TMP חינם עודף. מספר הטלומר גדל ועוצמת הטלומר ירדה עם הזמן.
תמונות מייצגות של APBs שזוהו על ידי דנ"א טלומר דגים וחלבון PML אם מוצגים כאן. תאים עם SIM מגויסים יש יותר APBs מאשר תאים עם מוטציה SIM מגויס, מה שמרמז על דימרציה המושרה עיבויים הם אכן APBs. בעת ביצוע פרוטוקול זה, אל תחשוף דימרימרים רגישים לאור לאור.
עבודה בחדר חשוך עם מנורה הפולטת אור אדום ועוטפת תאים בנייר אלומיניום במהלך הדגירה. לאחר הליך זה, תיוג קרבה יכול לשמש ליצירת רשימה מקיפה של רכיבים ב- Condensate המושרה. הדמיה חיה יכולה לשמש כדי לעקוב אחר הדינמיקה של רכיבים ביסוב.
שיטות אלה יכולות לסייע בקביעת התפקידים של בקרת קומפוזיציה עיבוי של שליטה.
