ויסות תרגום ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות המוח. פרופיל פוליזום מספק כלי שימושי ורב עוצמה להערכת מצב התרגום של mRNA, המאפשר לבחון פונקציות בקרה תרגום במהלך התפתחות המוח. שיטה זו היא גישה קלה וזולה כדי להפוך את מעברי צבע סוכרוז ולהעריך שבר פוליזום.
בפרוטוקול זה, הוא משמש לניתוח קליפת העכבר המתפתחת. עם זאת, זה יכול להיות מותאם בקלות ללמוד מערכות אחרות. התחל על ידי דילול 2.2 סוכרוז טוחנת להכין שישה 10 עד 50% שיפוע סוכרוז.
מלא מזרק 30 מיליליטר עם כ 16 מיליליטר של 10% סוכרוז, למקם אותו על משאבת המזרק ולחבר אותו למחט. ודא כי אין בועות אוויר במזרק, צינורות או מחט, ולנגב את קצה המחט כדי להסיר כל פתרון שיורית. הזז את השלב הממונע למעלה כך שקצה המחט נוגע במרכז הצינור בתחתית.
הגדר את משאבת המזרק לקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה עבור נפח של 2.3 מיליליטר. לאחר חלוקת 2.3 מיליליטר של 10% פתרון סוכרוז, לעבור את השלב הממונע ולחזור על התהליך עבור כל ששת שיפוע. לאחר מכן הוסיפו 20% פתרון סוכרוז לתחתית הצינורות ואחריו 30, 40 ו-50% אספו עוברי עכבר CD1 ביום העוברי 12 והניחו אותם בצלחת של 10 ס"מ המכילה HBSS קר כקרח על קרח.
תחת טווח הניתוח, להעביר עובר אחד לצלחת שישה סנטימטרים המכיל HBSS קר כקרח. השתמש 21 כדי 23 מחטים מד כדי לתקן את המיקום של הראש על ידי חדירה דרך העיניים בזווית של 45 מעלות ולהחיל כוח כדי לוודא את המחטים קבועים על הצלחת. השתמש מספר חמש מלקחיים כדי להסיר את העור ואת הגולגולת עובד מהאמצע לצדדים, ולאחר מכן לחתוך את נורות הריח ולהסיר את קרום המוח כדי לחשוף את הרקמות קליפת המוח.
השתמש מלקחיים מעוגלים לחתוך את הרקמות קליפת המוח לשניים עד שלושה מיליליטר של מדיום נוירובסאלי על קרח. משוך את הרקמות מעוברים שונים לפי הצורך. רקמות משמונה עד 10 עוברים בדרך כלל לתת כ 200 מיקרוגרם של RNA הכולל.
מוסיפים ציקלוהקסימיד למדיום הנוירו-בסל עם הרקמות המנותקות לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה הרקמה ב 500 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לשטוף את הרקמות פעמיים עם PBS קר כקרח בתוספת 100 מיקרוגרם לכל ציקלוהקסימיד מיליליטר.
הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה התא בתוספת ארבעה מיקרוליטרים של מעכב RNase ופיפט למעלה ולמטה כדי resuspend הרקמה. השתמש במחט אינסולין בעדינות lyse הרקמה. ואז דגירה על קרח במשך 10 דקות עם מערבולת קצרה כל שתיים עד שלוש דקות.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה lysate ב 2000 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על הקרח. חזור על תהליך זה פעם נוספת צנטריפוגה ב 13, 000 x g. לאחר העברת supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על קרח, למדוד את ריכוז RNA ברקמה lysate באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
לטעון את הדגימות על גבי שיפוע סוכרוז על ידי מחלק לאט את lysate לקירות של צינורות ultracentrifuge. מניחים בעדינות את שיפוע סוכרוז בדליים ו ultracentrifuge את הדגימות ב 190, 000 x g וארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. מניחים צינור אולטרה צנטריפוגה ריק על מדקר הצינור בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה.
מלא מזרק 30 מיליליטר עם 25 מיליליטר של 60% פתרון מרדף סוכרוז. לאחר מכן לחץ בעדינות על המזרק כך שתמיסת המרדף תמלא את הצינור הריק ותעבור דרך צג UV 254 ננומטר כדי להגדיר את הבסיס לגילוי. לחץ על אפס אוטומטי בצג ה- UV כדי לרשום תוכנית בסיסית לזיהוי ולאחר מכן הקש על הפעל בתוכנה כדי להתחיל בהקלטה.
ברגע שהמערכת קובעת בסיס, השהה את ההקלטה על התוכנה וחזר בו מפתרון המרדף, וודא שלא נשאר פתרון מרדף שיורית במערכת. לטעון צינור מדגם אחד על מדקר הצינור בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה. התחל להקליט על התוכנה, ודא כי אין בועות אוויר בשורה.
לאחר מכן הפעל את משאבת המזרק ואת אספן השברים כדי לאסוף שברים פוליזומים, הגדרת השבר ל 30 שניות. לאסוף את השברים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. הליסט הקליפתי המכיל RNA שנמשך משמונה עוברים הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל-12 שברים.
פסגות של ספיגת UV ב 254 ננומטר זיהו שברים המכילים את subunit 40S subunit 60S ו 80S מונוזום ופוליזומים. ניתוח השברים על ידי כתם מערבי עבור subunit ריבוזומלי גדול Rpl10 הראה את נוכחותה מונוזומים subunit 60S ו polysomes. לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים, Gapdh ו- Csde1, לא היו קשורים לריבוזומים, אלא הועשרו בשברים המכילים רנ"א חופשי.
בהתאם להפרדת חלבונים בשברים שונים, Gapdh ו- sox2 mRNAs היו מועשרים מאוד בשברים המכילים פוליזומים כבדים, דבר המצביע על כך ש- mRNAs אלה מתורגמים ביעילות בקליפת המוח המתפתחת. לעומת זאת, rpl7 ו- rpl35 mRNAs הועשרו בשבר המכיל מונוזומים, מה שמרמז על תרגום מודחק. כדי להשיג תוצאות לשחזור, חשוב לשמור על עקביות בביצוע מעברי צבע סוכרוז.
משאבות המזרק יש להשתמש כדי להוציא את סוכרוז. במהלך השבר ואיסוף המדגם, חשוב לשטוף את המערכת עם מים ללא RNase. פעולה זו מפחיתה את כל שאריות סוכרוז שנותרו מהמדגם הקודם.
שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs ברקמות שונות. באמצעות הפלטפורמה, ניתן להשיג מעברי צבע עקביים ליצירת פרופיל פוליזום, המספק פתרון בעלות נמוכה עבור טכניקה קלאסית ושימושית זו.
