번역 조절은 뇌 발달에 중요한 역할을 합니다. 다각성 프로파일링은 mRNA의 번역 상태를 평가하는 유용하고 강력한 도구를 제공하여 뇌 발달 중에 번역 제어 기능을 검사할 수 있습니다. 이 방법은 자당 그라데이션을 만들고 다일부 분획을 평가하기 위한 쉽고 저렴한 접근 방식입니다.
이 프로토콜에서, 개발 중인 마우스 피질을 분석하는 데 사용된다. 그러나 다른 시스템을 연구하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 먼저 2.2 어어 자당을 희석하여 6 개의 10 ~ 50 % 자당 그라데이션을 준비하십시오.
30 밀리리터 주사기를 약 16밀리리터의 10% 자당으로 채우고 주사기 펌프에 놓고 바늘에 연결합니다. 주사기, 튜브 또는 바늘에 기포가 없는지 확인하고 바늘 끝을 닦아 잔류 용액을 제거하십시오. 바늘 의 끝이 하단에 튜브의 중심에 닿을 수 있도록 전동 단계를 이동합니다.
주사기 펌프를 분당 2밀리리터의 유량으로 설정하여 2.3밀리리터의 부피를 설정합니다. 10% 자당 용액의 2.3 밀리리터를 분배한 후, 전동 스테이지를 아래로 이동하고 6개의 그라데이션 모두에 대한 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 튜브 바닥에 20% 자당 용액을 넣고 12일째에 CD1 마우스 배아를 수집하고 얼음에 차가운 HBSS를 함유한 10센티미터 플레이트에 넣습니다.
해부 범위하에서, 얼음 차가운 HBSS를 포함하는 6센티미터 판으로 1개의 태아를 전송합니다. 21~23게이지 바늘을 사용하여 45도 각도로 눈을 관통하여 머리의 위치를 고정하고 바늘이 플레이트에 고정되도록 힘을 가하십시오. 5번 포셉을 사용하여 가운데에서 측면으로 작동하는 피부와 두개골을 제거한 다음 후각 전구를 자르고 수막을 제거하여 피질 조직을 노출합니다.
곡선 된 집게를 사용하여 얼음에 신경 물질 매체의 2 ~ 3 밀리리터로 피질 조직을 잘라. 필요에 따라 다른 배아에서 조직을 당깁니다. 8에서 10개의 태아에서 조직은 일반적으로 총 RNA의 대략 200 마이크로그램을 줍니다.
해부된 조직을 가진 신경 물질 배지에 사이클로헨시미드를 넣고 밀리리터당 100 마이크로그램의 최종 농도를, 10분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 티슈는 500 x g에서 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 밀리리터 사이클로헤시미드당 100 마이크로그램으로 보충된 얼음 차가운 PBS로 조직을 두 번 씻으시다.
조직을 다시 억제하기 위해 RNase 억제제와 파이펫의 4개의 마이크로리터로 보충된 세포 용해 완충제 500마이크로리터를 추가합니다. 인슐린 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 lyse하십시오. 그런 다음 2~3분마다 간단한 소용돌이로 10분 간 얼음에 배양합니다.
인큐베이션 후, 1심분리는 섭씨 4도에서 5분간 2000 x g의 lysate을 원심분리하고 상류체를 얼음 위에 새로운 원심분리기 튜브로 옮긴다. 이 프로세스를 13, 000 x g에서 원심 분리한 후 한 번 더 반복합니다. 얼음에 새로운 원심분리기 튜브로 상체를 옮김한 후 UV-Vis 분광광계를 사용하여 조직의 RNA 농도를 측정합니다.
초원심분리기 튜브의 벽에 리자테를 천천히 분배하여 자당 그라데이션 위에 샘플을 적재합니다. 자당 그라데이션을 양동이에 부드럽게 놓고 샘플을 190, 000 x g 및 섭씨 4도에서 90 분 동안 초원심 분리합니다. 튜브 피어서에 빈 초원심분리기 튜브를 놓고 바닥에서 바늘로 튜브를 부드럽게 관통합니다.
30 밀리리터 주사기를 60% 자당 추적 용액의 25 밀리리터로 채웁니다. 그런 다음 주사기를 부드럽게 눌러 서채용이 빈 튜브를 채우고 254 나노미터 UV 모니터를 통과하여 검출기준을 설정합니다. UV 모니터에서 자동 0을 눌러 감지 기준선을 등록한 다음 소프트웨어에서 재생을 눌러 녹화를 시작합니다.
시스템이 기준선을 설정하면 소프트웨어에서 레코딩을 일시 중지하고 추적 솔루션을 철회하여 잔류 추적 솔루션이 시스템에 남아 있지 않도록 합니다. 튜브 피어서에 샘플 튜브 하나를 로드하고 부드럽게 바닥에서 바늘로 튜브를 관통. 소프트웨어에 녹음을 시작, 라인에 기포가 없는지 확인합니다.
그런 다음 주사기 펌프와 분획 수집기를 시작하여 다각형 분획을 수집하여 분수를 30초로 설정합니다. 1.5 밀리리터 튜브로 분수를 수집합니다. 8개의 배아에게서 뽑아낸 RNA를 포함하는 피질 리세트는 12개의 분획으로 자당 그라데이션에 의해 분리되었다.
254 나노미터에서 UV 흡광도의 피크는 40S 하위 유닛 60S 하위 단위 및 80S 단조및 다낭을 포함하는 분획을 확인했습니다. 큰 리보솜 서브유닛 Rpl10에 대한 서양 블롯에 의한 분획의 분석은 60S 서브유닛 단조및 다일부에서의 존재를 나타냈다. 대조적으로, 세포질 단백질, Gapdh 및 Csde1는 리보솜과 연관되지 않았지만, 자유 RNA를 포함하는 분수에서 풍부하게 되었다.
다른 분획에서 단백질의 분리와 일치, Gapdh와 sox2 mRNAs는 무거운 폴리좀을 포함하는 분획에서 높게 농축되었다, 이러한 mRNAs는 개발 피질에서 효율적으로 번역되는 것을 시사. 대조적으로, rpl7 및 rpl35 mRNAs는 단량체를 포함하는 분획에서 풍부하게 되었다, 억압된 번역을 건의합니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 자당 그라데이션을 만드는 데 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.
주사기 펌프는 자당을 배출하는 데 사용해야합니다. 분수 및 샘플 수집 중에 RNase가 없는 물로 시스템을 세척하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이전 샘플에서 남은 잔류 자당이 줄어듭니다.
이 방법은 다양한 조직에서 mRNA의 번역 상태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 플랫폼을 사용하면 다각형 프로파일링을 위한 일관된 그라데이션을 얻을 수 있으며, 이 고전적인 유용한 기술에 대한 저비용 솔루션을 제공합니다.
