A regulação translacional desempenha um papel importante no desenvolvimento cerebral. O perfil polimento fornece uma ferramenta útil e poderosa para avaliar o status translacional do mRNA, possibilitando examinar as funções de controle translacional durante o desenvolvimento cerebral. Este método é uma abordagem fácil e de baixo custo para fazer gradientes de sacarose e avaliar fracionamento polissó.
Neste protocolo, é usado para analisar o córtex do rato em desenvolvimento. No entanto, pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas. Comece diluindo 2,2 sacarose molar para preparar seis gradientes de 10 a 50%.
Encha uma seringa de 30 mililitros com aproximadamente 16 mililitros de 10% de sacarose, coloque-a na bomba de seringa e conecte-a à agulha. Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa, tubo ou agulha, e limpe a ponta da agulha para remover qualquer solução residual. Mova o estágio motorizado para cima de tal forma que a ponta da agulha toque o centro do tubo na parte inferior.
Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto para um volume de 2,3 mililitros. Depois de distribuir 2,3 mililitros de solução de 10% de sacarose, mova-se para baixo do estágio motorizado e repita o processo para todos os seis gradientes. Em seguida, adicione 20% de solução de sacarose ao fundo dos tubos seguido por 30, 40 e 50% Colete embriões de camundongos CD1 no dia 12 embrionário e coloque-os em uma placa de 10 centímetros contendo HBSS gelado no gelo.
Sob o escopo de dissecção, transfira um embrião para uma placa de seis centímetros contendo HBSS gelado. Use agulhas de 21 a 23 para fixar a posição da cabeça penetrando através dos olhos em um ângulo de 45 graus e aplique uma força para garantir que as agulhas estejam fixas na placa. Use fórceps número cinco para remover a pele e o crânio trabalhando do meio para os lados, em seguida, corte as lâmpadas olfativas e remova as meninges para expor os tecidos corticais.
Use fórceps curvos para cortar os tecidos corticais em dois a três mililitros de meio neurobásal no gelo. Puxe os tecidos de diferentes embriões conforme necessário. Tecidos de oito a 10 embriões geralmente dão aproximadamente 200 microgramas de RNA total.
Adicione cicloheximida ao meio neurobásio com os tecidos dissecados a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugar o tecido a 500 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernasal. Lave os tecidos duas vezes com PBS gelado suplementado com 100 microgramas por cicloheximida mililitro.
Adicione 500 microliters de tampão de lise celular suplementados com quatro microliters de inibidor RNase e pipeta para cima e para baixo para resuspend o tecido. Use uma agulha de insulina para lise suavemente o tecido. Em seguida, incubar no gelo por 10 minutos com breve vórtice a cada dois ou três minutos.
Após a incubação, centrifugar o lysate a 2000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius e transferir o supernasce para um novo tubo de centrífuga no gelo. Repita este processo mais uma vez centrifugando a 13.000 x g. Depois de transferir o supernascedor para um novo tubo de centrífuga no gelo, meça a concentração de RNA no tecido lysate usando um espectrofotômetro UV-Vis.
Carregue as amostras em cima dos gradientes de sacarose, distribuindo lentamente o lise para as paredes dos tubos ultracentríficos. Coloque suavemente os gradientes de sacarose nos baldes e ultracentrize as amostras a 190,000 x g e quatro graus Celsius por 90 minutos. Coloque um tubo de ultracentrifutura vazio no perfurador do tubo e penetre suavemente o tubo com a agulha de baixo.
Encha uma seringa de 30 mililitros com 25 mililitros de solução de perseguição de 60% de sacarose. Em seguida, pressione suavemente a seringa de tal forma que a solução de perseguição encha o tubo vazio e passe pelo monitor UV de 254 nanômetros para definir a linha de base para detecção. Pressione auto zero no monitor UV para registrar uma linha de base para detecção e pressione Play no software para começar a gravar.
Uma vez que o sistema estabeleça uma linha de base, pausa a gravação no software e retraia a solução de perseguição, certificando-se de que nenhuma solução de perseguição residual permaneça no sistema. Carregue um tubo de amostra no perfurador do tubo e penetre suavemente o tubo com a agulha de baixo. Comece a gravar no software, certifique-se de que não há bolhas de ar na linha.
Em seguida, inicie a bomba de seringa e o coletor de frações para coletar frações de polímio, definindo o fracionador para 30 segundos. Colete as frações em tubos de 1,5 mililitro. O lysato cortical contendo RNA extraído de oito embriões foi separado por um gradiente de sacarose em 12 frações.
Picos de absorção UV a 254 nanômetros identificaram frações contendo a subunidade 40S 60S e monossóis e polissomos 80S. A análise das frações por mancha ocidental para a grande subunidade ribossômica Rpl10 mostrou sua presença nos monossómos e polissóis da subunidade 60S. Em contraste, as proteínas citoplasmáticas, Gapdh e Csde1, não foram associadas a ribossomos, mas foram enriquecidas em frações contendo RNA livre.
Consistente com a separação de proteínas em diferentes frações, Gapdh e sox2 mRNAs foram altamente enriquecidos nas frações contendo polissomas pesados, sugerindo que esses mRNAs são traduzidos eficientemente no córtex em desenvolvimento. Em contraste, rpl7 e rpl35 mRNAs foram enriquecidos na fração contendo monossomos, sugerindo tradução reprimida. Para obter resultados reprodutíveis, é importante manter a consistência na confecção de gradientes de sacarose.
As bombas de seringa devem ser usadas para ejetar a sacarose. Durante o fracionamento e coleta de amostras, é importante lavar o sistema com água sem RNase. Isso reduz qualquer sacarose residual remanescente da amostra anterior.
Este método pode ser usado para avaliar o status translacional de mRNAs em vários tecidos. Utilizando a plataforma, podem ser obtidos gradientes consistentes para perfis polissários, o que fornece uma solução de baixo custo para esta técnica clássica e útil.
