トランスレーショナルレギュレーションは脳の発達に重要な役割を果たしています。ポリソームプロファイリングは、mRNAの翻訳状態を評価するための有用かつ強力なツールを提供し、脳の発達中に翻訳制御機能を調べることができます。この方法は、スクロース勾配を作成し、ポリソーム分画を評価するための簡単で低コストのアプローチです。
このプロトコルでは、開発中のマウス皮質を分析するために使用されます。しかし、他のシステムを研究するために容易に適応させることができる。2.2モルショ糖を希釈して6つの10〜50%のショ糖勾配を調製します。
30ミリリットルのシリンジに約16ミリリットルの10%スクロースを充填し、シリンジポンプに置き、針に接続します。注射器、チューブ、または針に気泡がないことを確認し、針の先端を拭いて残留液を取り除きます。針の先端が下部のチューブの中央に触れるようなモーターステージを上に移動します。
シリンジポンプを1分あたり2ミリリットルの流量に設定し、体積は2.3ミリリットルです。10%スクロース溶液の2.3ミリリットルを分配した後、電動ステージを下に移動し、6つの勾配すべてについてプロセスを繰り返します。その後、チューブの下部に20%スクロース溶液を加え、次いで胚12日目にCD1マウス胚を30、4、50%収集し、氷冷HBSSを含む10センチメートルのプレートに氷の上に置きます。
解剖範囲の下で、1つの胚を氷冷HBSSを含む6センチメートルのプレートに移す。21~23本のゲージ針を使用して、45度の角度で目を貫通して頭部の位置を固定し、針がプレートに固定されていることを確認するために力を加えます。5番の鉗子を使用して、皮膚と頭蓋骨を中央から側面に取り除き、嗅球を切り、髄液を取り除いて皮質組織を露出させます。
湾曲した鉗子を使用して、皮質組織を氷上の神経基底培地の2〜3ミリリットルに切断する。必要に応じて異なる胚から組織を引っ張ります。8~10個の胚の組織は、通常、総RNAの約200マイクログラムを与える。
解剖した組織を含む神経基底培地にサイクロヘキシミドを加え、1ミリリットル当たり100マイクログラムの最終濃度にし、摂氏37度で10分間インキュベートする。500 x g で 5 分間摂氏 4 度で組織を遠心分離し、上清を捨てます。氷冷PBSで2回、ミリリットルシクロヘキシミドあたり100マイクログラムを加えた組織を洗浄します。
500マイクロリットルの細胞ライシスバッファーを加え、4マイクロリットルのRNase阻害剤とピペットを上下に添加して組織を再中断します。インスリン針を使用して、組織を穏やかに取り付けます。その後、2〜3分ごとに短い渦で10分間氷の上でインキュベートします。
インキュベーション後、2000 x gでリセートを摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を氷上の新しい遠心分離管に移します。このプロセスを13,000 x gでもう一度遠心分離を繰り返します。上清を氷上の新しい遠心管に移した後、UV-Vis分光光度計を用いて組織ライセート中のRNA濃度を測定する。
スクロースの勾配の上にサンプルをロードし、ゆっくりと超遠心チューブの壁にライゼートを分配します。バケツにスクロースの勾配をそっと入れ、サンプルを190、000 x g、摂氏4度で90分間超遠心分離します。チューブピアサーに空の超遠心チューブを置き、下から針でチューブをそっと貫通します。
60%スクロースチェイス溶液の25ミリリットルで30ミリリットルのシリンジを充填します。次に、チェイス溶液が空のチューブを満たし、254ナノメートルのUVモニタを通過して検出用のベースラインを設定するように、注射器を静かに押します。UV モニタの auto 0 キーを押して検出用のベースラインを登録し、ソフトウェアの再生を押して録音を開始します。
システムがベースラインを確立したら、ソフトウェアの記録を一時停止し、追跡ソリューションを撤回し、システムに残った追跡ソリューションが残らないようにします。チューブピアサーにサンプルチューブを1つロードし、下から針でチューブをそっと貫通します。ソフトウェアでの録音を開始し、ラインに気泡がないことを確認してください。
次に、シリンジポンプと分数コレクターを起動して、ポリサム分画を収集し、分数を30秒に設定します。1.5ミリリットルのチューブに分数を収集します。8個の胚から引き出されたRNAを含む皮質リセートを、スクロース勾配によって12画分に分離した。
254ナノメートルのUV吸光度のピークは、40Sサブユニット60Sサブユニットと80Sモノソームとポリソームを含む画分を同定した。大きいリボソームサブユニットRpl10のウェスタンブロットによる分画の分析は、60Sサブユニット単数体およびポリソームにおけるその存在を示した。対照的に、細胞質タンパク質、GapdhおよびCsde1は、リボソームと関連していなかったが、遊離RNAを含む画分で濃縮された。
異なる画分におけるタンパク質の分離と一致して、Gapdhとsox2 mRNAは重いポリソームを含む画分において高度に濃縮され、これらのmRNAが現像皮質で効率的に翻訳されることを示唆している。対照的に、rpl7およびrpl35 mRNAは単数を含む分数で濃縮され、抑圧された翻訳を示唆した。再現性のある結果を得るためには、ショ糖勾配の作成において一貫性を保つ事が重要です。
シリンジポンプは、スクロースを排出するために使用する必要があります。分画およびサンプル採取の間に、RNaseフリーの水でシステムを洗浄することが重要である。これにより、前のサンプルから残っている残りのスクロースが減少します。
この方法は、様々な組織におけるmRNAの翻訳ステータスを評価するために使用することができる。このプラットフォームを使用すると、ポリサムプロファイリング用の一貫した勾配を取得できるため、この古典的で便利な手法に対する低コストのソリューションが提供されます。
