La regolazione traslizionale svolge un ruolo importante nello sviluppo cerebrale. La profilazione polisoma fornisce uno strumento utile e potente per valutare lo stato traslazionale dell'mRNA, rendendo possibile esaminare le funzioni di controllo traslazionale durante lo sviluppo cerebrale. Questo metodo è un approccio facile e a basso costo per creare gradienti di saccarosio e valutare il frazionamento polisoma.
In questo protocollo, viene utilizzato per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Tuttavia, può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi. Iniziare diluire il saccarosio molare 2.2 per preparare sei gradienti di saccarosio dal 10 al 50%.
Riempire una siringa da 30 millilitri con circa 16 millilitri di saccarosio al 10%, posizionarla sulla pompa della siringa e collegarla all'ago. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa, nel tubo o nell'ago e pulire la punta dell'ago per rimuovere qualsiasi soluzione residua. Spostare lo stadio motorizzato verso l'alto in modo che la punta dell'ago tocchi il centro del tubo nella parte inferiore.
Impostare la pompa della siringa su una portata di due millilitri al minuto per un volume di 2,3 millilitri. Dopo aver erogato 2,3 millilitri di soluzione di saccarosio al 10%, spostare verso il basso lo stadio motorizzato e ripetere il processo per tutti e sei i gradienti. Quindi aggiungere la soluzione di saccarosio al 20% sul fondo dei tubi seguita da 30, 40 e 50%Raccogliere embrioni di topo CD1 al giorno 12 embrionale e metterli in una piastra di 10 centimetri contenente HBSS ghiacciato sul ghiaccio.
Sotto l'ambito della dissezione, trasferire un embrione su una piastra di sei centimetri contenente HBSS ghiacciato. Utilizzare aghi da 21 a 23 calibro per fissare la posizione della testa penetrando attraverso gli occhi con un angolo di 45 gradi e applicare una forza per assicurarsi che gli aghi siano fissati sulla piastra. Utilizzare le forcelle numero cinque per rimuovere la pelle e il cranio che lavorano dal centro ai lati, quindi tagliare i bulbi olfattivi e rimuovere le meningi per esporre i tessuti corticali.
Utilizzare forcelle curve per tagliare i tessuti corticali in due o tre millilitri di mezzo neurobasale sul ghiaccio. Estrarre i tessuti da diversi embrioni in base alle esigenze. I tessuti da otto a 10 embrioni di solito danno circa 200 microgrammi di RNA totale.
Aggiungere il cicloeximide al mezzo neurobasale con i tessuti sezionati a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare il tessuto a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Lavare i tessuti due volte con PBS ghiacciato integrato con 100 microgrammi per cicloesiuro millilitro.
Aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi cellulare integrati con quattro microlitri di inibitore della RNasi e pipetta su e giù per rimescolare il tessuto. Utilizzare un ago di insulina per liscigere delicatamente il tessuto. Quindi incubare sul ghiaccio per 10 minuti con un breve vortice ogni due o tre minuti.
Dopo l'incubazione, centrifugare il lisato a 2000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga su ghiaccio. Ripetere questo processo ancora una volta centrifugando a 13.000 x g. Dopo aver trasferito il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga sul ghiaccio, misurare la concentrazione di RNA nel lisato tissutale utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.
Caricare i campioni sopra i gradienti di saccarosio erogando lentamente il llysate alle pareti dei tubi ultracentrifugo. Posizionare delicatamente le sfumature di saccarosio nei secchi e ultracentrifugare i campioni a 190, 000 x g e quattro gradi Celsius per 90 minuti. Posizionare un tubo ultracentrifugo vuoto sul piercer del tubo e penetrare delicatamente nel tubo con l'ago dal basso.
Riempire una siringa da 30 millilitri con 25 millilitri di soluzione di inseguimento al saccarosio al 60%. Quindi premere delicatamente la siringa in modo che la soluzione di inseguimento riempia il tubo vuoto e passa attraverso il monitor UV da 254 nanometri per impostare la linea di base per il rilevamento. Premere zero automatico sul monitor UV per registrare una linea di base per il rilevamento, quindi premere Riproduci sul software per iniziare la registrazione.
Una volta che il sistema stabilisce una linea di base, sospendere la registrazione sul software e ritirare la soluzione di inseguimento, assicurandosi che non rimanga alcuna soluzione di inseguimento residua nel sistema. Caricare un tubo campione sul piercer del tubo e penetrare delicatamente nel tubo con l'ago dal basso. Inizia a registrare sul software, assicurati che non ci siano bolle d'aria nella linea.
Quindi avviare la pompa della siringa e il raccoglitore di frazioni per raccogliere frazioni polisoma, impostando il frazionatore su 30 secondi. Raccogliere le frazioni in tubi da 1,5 millilitri. Il lisato corticale contenente RNA estratto da otto embrioni è stato separato da un gradiente di saccarosio in 12 frazioni.
Picchi di assorbanza UV a 254 nanometri hanno identificato frazioni contenenti la subunità 40S 60S e il monosome 80S e i polisomei. L'analisi delle frazioni da parte della macchia occidentale per la grande subunità ribosomiale Rpl10 ha mostrato la sua presenza nei monosomi e nei polisomi della subunità 60S. Al contrario, le proteine citoplasmatiche Gapdh e Csde1, non erano associate ai ribosomi, ma erano arricchite in frazioni contenenti RNA libero.
Coerentemente con la separazione delle proteine in diverse frazioni, gapdh e sox2 mRNA erano altamente arricchiti nelle frazioni contenenti polisomi pesanti, suggerendo che questi mRNA sono tradotti in modo efficiente nella corteccia in via di sviluppo. Al contrario, rpl7 e rpl35 mRNA sono stati arricchiti nella frazione contenente monosomi, suggerendo una traduzione repressa. Per ottenere risultati riproducibili, è importante mantenere la coerenza nella realizzazione di gradienti di saccarosio.
Le pompe per siringhe devono essere utilizzate per espellere il saccarosio. Durante il frazionamento e la raccolta del campione, è importante lavare il sistema con acqua priva di RNasi. Ciò riduce il saccarosio residuo rimanente dal campione precedente.
Questo metodo può essere utilizzato per valutare lo stato traslazionale degli mRNA in vari tessuti. Utilizzando la piattaforma, è possibile ottenere gradienti coerenti per la profilatura polisome, che fornisce una soluzione a basso costo per questa tecnica classica e utile.
