Die translationale Regulierung spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Gehirns. Polysome Profiling bietet ein nützliches und leistungsstarkes Werkzeug, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, was es ermöglicht, translationale Steuerungsfunktionen während der Gehirnentwicklung zu untersuchen. Diese Methode ist ein einfacher und kostengünstiger Ansatz, um Saccharosegradienten zu machen und die Polysomenfraktionierung zu bewerten.
In diesem Protokoll wird es verwendet, um den sich entwickelnden Mauskortex zu analysieren. Es kann jedoch leicht an andere Systeme angepasst werden. Beginnen Sie mit der Verdünnung von 2,2 Molsaccharose, um sechs 10 bis 50%Saccharose-Gradienten zuzubereiten.
Füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit ca. 16 Millilitern 10%Saccharose, legen Sie sie auf die Spritzenpumpe und schließen Sie sie an die Nadel an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze, Schläuche oder Nadel befinden, und wischen Sie die Nadelspitze ab, um Restlösung zu entfernen. Bewegen Sie die motorisierte Bühne so nach oben, dass die Spitze der Nadel die Mitte des Rohres an der Unterseite berührt.
Stellen Sie die Spritzenpumpe bei einem Volumen von 2,3 Millilitern auf einen Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute ein. Nach der Abgabe von 2,3 Milliliter10%Saccharose-Lösung, bewegen Sie sich die motorisierte Stufe nach unten und wiederholen Sie den Prozess für alle sechs Steigungen. Dann fügen Sie 20%Saccharose-Lösung auf den Boden der Röhren gefolgt von 30, 40 und 50%Sammeln CD1 Maus Embryonen am embryonalen Tag 12 und legen Sie sie in einer 10-Zentimeter-Platte mit eiskalten HBSS auf Eis.
Übertragen Sie im Sezierbereich einen Embryo auf eine sechs Zentimeter große Platte, die eiskalte HBSS enthält. Verwenden Sie 21 bis 23 Messgerätnadeln, um die Position des Kopfes zu fixieren, indem Sie durch die Augen in einem 45-Grad-Winkel eindringen und eine Kraft anwenden, um sicherzustellen, dass die Nadeln auf der Platte befestigt sind. Verwenden Sie Nummer fünf Zangen, um die Haut und Schädel arbeiten von der Mitte zu den Seiten zu entfernen, dann schneiden Sie die olfaktorischen Glühbirnen und entfernen Sie die Menings, um die kortikalen Gewebe auszusetzen.
Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das kortikale Gewebe in zwei bis drei Milliliter neurobasales Medium auf Eis zu schneiden. Ziehen Sie die Gewebe aus verschiedenen Embryonen nach Bedarf. Gewebe von acht bis zehn Embryonen ergeben in der Regel etwa 200 Mikrogramm Gesamt-RNA.
Fügen Sie Cycloheximid dem neurobasalen Medium mit dem sezierten Gewebe zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und brüten sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Gewebe zweimal mit eiskaltem PBS, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheximid.
Fügen Sie 500 Mikroliter Zelllysepuffer hinzu, ergänzt durch vier Mikroliter RNase-Inhibitor und Pipette nach oben und unten, um das Gewebe wieder aufzuhängen. Verwenden Sie eine Insulinnadel, um das Gewebe sanft zu lysieren. Dann auf Eis für 10 Minuten mit kurzen Wirbel alle zwei bis drei Minuten inkubieren.
Nach der Inkubation zentrieren Sie das Lysat bei 2000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal Zentrifugieren bei 13.000 x g. Nach der Übertragung des Überstandes auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis, messen Sie die RNA-Konzentration im Gewebelysat mit einem UV-Vis Spektrophotometer.
Laden Sie die Proben auf die Saccharosegradienten, indem Sie das Lysat langsam an die Wände der Ultrazentrifugenrohre abgeben. Die Saccharose-Gradienten vorsichtig in die Eimer legen und die Proben 90 Minuten bei 190, 000 x g und vier Grad Celsius ultrazentrieren. Legen Sie ein leeres Ultrazentrifugenrohr auf den Rohrpiercer und dringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr ein.
Füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit 25 Millilitern 60%Saccharose-Chase-Lösung. Drücken Sie dann vorsichtig die Spritze so, dass die Chase-Lösung das leere Rohr füllt und durch den 254 Nanometer UV-Monitor geht, um die Basis für die Detektion festzulegen. Drücken Sie auf dem UV-Monitor auf Auto Zero, um eine Baseline für die Erkennung zu registrieren, und drücken Sie dann Play auf der Software, um mit der Aufzeichnung zu beginnen.
Sobald das System eine Baseline erstellt hat, halten Sie die Aufzeichnung auf der Software an und ziehen Sie die Chase-Lösung zurück, um sicherzustellen, dass keine Restverfolgungslösung im System verbleibt. Laden Sie ein Probenrohr auf den Rohrpiercer und dringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr ein. Beginnen Sie mit der Aufnahme auf der Software, stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Linie befinden.
Starten Sie dann die Spritzenpumpe und den Bruchkollektor, um Polysomenfraktionen zu sammeln, und stellen Sie den Fraktionator auf 30 Sekunden ein. Sammeln Sie die Fraktionen in 1,5 Milliliter-Röhren. Das kortikale Lysat, das RNA aus acht Embryonen enthält, wurde durch einen Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt.
Peaks der UV-Absorption bei 254 Nanometern identifiziert Fraktionen, die die 40S Untereinheit 60S Untereinheit und 80S Monosomen und Polysomen enthalten. Die Analyse der Fraktionen durch Western Blot für die große ribosomale Untereinheit Rpl10 zeigte ihre Präsenz in den 60S-Untereinheitsmonosomen und Polysomen. Im Gegensatz dazu wurden zytoplasmatische Proteine, Gapdh und Csde1, nicht mit Ribosomen assoziiert, sondern in Fraktionen angereichert, die freie RNA enthielten.
In Übereinstimmung mit der Trennung von Proteinen in verschiedenen Fraktionen wurden Gapdh und sox2 mRNAs in den Fraktionen, die schwere Polysomen enthalten, stark angereichert, was darauf hindeutet, dass diese mRNAs effizient in den sich entwickelnden Kortex übersetzt werden. Im Gegensatz dazu wurden rpl7 und rpl35 mRNAs in der Fraktion angereichert, die Monosomen enthält, was auf eine verdrängte Übersetzung hindeutet. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Konsistenz bei der Herstellung von Saccharosegradienten aufrechtzuerhalten.
Die Spritzenpumpen sollten zum Auswerfen der Saccharose verwendet werden. Bei der Fraktionierung und Probenentnahme ist es wichtig, das System mit RNase-freiem Wasser zu waschen. Dadurch werden restliche Saccharose aus der vorherigen Probe reduziert.
Diese Methode kann verwendet werden, um den Translationsstatus von mRNAs in verschiedenen Geweben zu bewerten. Mit hilfe der Plattform können konsistente Gradienten für die Polysomenprofilierung erzielt werden, was eine kostengünstige Lösung für diese klassische und nützliche Technik bietet.
