La regulación traslacional desempeña un papel importante en el desarrollo cerebral. La elaboración de perfiles de polisoma proporciona una herramienta útil y potente para evaluar el estado traslacional del ARNM, lo que permite examinar las funciones de control traslacional durante el desarrollo cerebral. Este método es un enfoque fácil y de bajo costo para hacer gradientes de sacarosa y evaluar el fraccionamiento de polisomas.
En este protocolo, se utiliza para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Sin embargo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas. Comience diluyendo 2,2 sacarosa molar para preparar seis gradientes de sacarosa de 10 a 50%.
Llene una jeringa de 30 mililitros con aproximadamente 16 mililitros de 10% de sacarosa, colóquela en la bomba de jeringa y conéctelo a la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa, tubo o aguja, y limpie la punta de la aguja para eliminar cualquier solución residual. Mueva la etapa motorizada hacia arriba de tal forma que la punta de la aguja toque el centro del tubo en la parte inferior.
Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de dos mililitros por minuto para un volumen de 2,3 mililitros. Después de dispensar 2,3 mililitros de solución de sacarosa al 10%, baje la etapa motorizada y repita el proceso para los seis gradientes. Luego agrega una solución de sacarosa al 20% a la parte inferior de los tubos seguida de 30, 40 y 50% Colecciona embrionarios de ratón CD1 en el día embrionario 12 y colócalos en una placa de 10 centímetros que contiene HBSS helado sobre hielo.
Bajo el alcance de disección, transfiera un embrión a una placa de seis centímetros que contenga HBSS helado. Utilice agujas de calibre 21 a 23 para fijar la posición de la cabeza penetrando a través de los ojos en un ángulo de 45 grados y aplique una fuerza para asegurarse de que las agujas estén fijas en la placa. Utilice fórceps número cinco para eliminar la piel y el cráneo que trabajan desde el centro hasta los lados, luego corte las bombillas olfativas y retire las meninges para exponer los tejidos corticales.
Utilice fórceps curvos para cortar los tejidos corticales en dos a tres mililitros de medio neurobasal sobre hielo. Extraiga los tejidos de diferentes embriones según sea necesario. Los tejidos de ocho a 10 embriones generalmente dan aproximadamente 200 microgramos de ARN total.
Añadir cicloheximida al medio neurobasal con los tejidos diseccionados a una concentración final de 100 microgramos por mililitro e incubar a 37 grados Centígrados durante 10 minutos. Centrífuga el tejido a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y deseche el sobrenadante. Lave los tejidos dos veces con PBS frío y helado complementado con 100 microgramos por cicloheximida de mililitro.
Añadir 500 microlitros de amortiguador de lisis celular complementado con cuatro microlitros de inhibidor de la RNase y pipeta arriba y abajo para resuspend el tejido. Utilice una aguja de insulina para liar suavemente el tejido. Luego incubar en hielo durante 10 minutos con breve vórtice cada dos o tres minutos.
Después de la incubación, centrífuga el lisato a 2000 x g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo. Repita este proceso una vez más centrifugando a 13.000 x g. Después de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo, mida la concentración de ARN en el tejido lisato utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
Cargue las muestras sobre los gradientes de sacarosa dispensando lentamente el lisato a las paredes de los tubos ultracentrífugas. Coloque suavemente los gradientes de sacarosa en los cubos y ultracentrífuga las muestras a 190.000 x g y cuatro grados Celsius durante 90 minutos. Coloque un tubo de ultracentrífuga vacío en el perforador del tubo y penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior.
Llene una jeringa de 30 mililitros con 25 mililitros de solución de persecución de sacarosa al 60%. A continuación, presione suavemente la jeringa de tal manera que la solución de persecución llene el tubo vacío y pase por el monitor UV de 254 nanómetros para establecer la línea de base para su detección. Pulse auto cero en el monitor UV para registrar una línea base para su detección y, a continuación, pulse Reproducir en el software para comenzar a grabar.
Una vez que el sistema establece una línea base, pausa la grabación en el software y retrae la solución de persecución, asegurándose de que no quede ninguna solución de persecución residual en el sistema. Cargue un tubo de muestra en el perforador del tubo y penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior. Comience a grabar en el software, asegúrese de que no hay burbujas de aire en la línea.
A continuación, inicie la bomba de jeringa y el colector de fracción para recoger fracciones de polisoma, estableciendo el fraccionario en 30 segundos. Recoge las fracciones en tubos de 1,5 mililitros. El lisato cortical que contenía ARN extraído de ocho embriones fue separado por un gradiente de sacarosa en 12 fracciones.
Picos de absorbancia UV a 254 nanómetros identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S subunit 60S y 80S monosoma y polisomas. El análisis de las fracciones por mancha occidental para el gran subunit ribosomal Rpl10 mostró su presencia en los monosomas y polisomas de subbunit 60S. Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas, Gapdh y Csde1, no se asociaron con ribosomas, sino que se enriquecieron en fracciones que contenían ARN libre.
En consonancia con la separación de proteínas en diferentes fracciones, gapdh y sox2 mRNAs fueron altamente enriquecidos en las fracciones que contienen polisomas pesados, lo que sugiere que estos ARNM se traducen eficientemente en la corteza en desarrollo. Por el contrario, rpl7 y rpl35 mRNAs se enriquecieron en la fracción que contiene monosomas, lo que sugiere una traducción reprimida. Para obtener resultados reproducibles, es importante mantener la consistencia en la fabricación de gradientes de sacarosa.
Las bombas de jeringa deben utilizarse para expulsar la sacarosa. Durante el fraccionamiento y la recolección de muestras, es importante lavar el sistema con agua libre de RNase. Esto reduce cualquier sacarosa residual restante de la muestra anterior.
Este método se puede utilizar para evaluar el estado traslacional de los mRNAs en varios tejidos. Utilizando la plataforma, se pueden obtener gradientes consistentes para la generación de perfiles de polisomas, lo que proporciona una solución de bajo costo para esta técnica clásica y útil.
