Переводное регулирование играет важную роль в развитии мозга. Поликом-профилирование является полезным и мощным инструментом для оценки переводного состояния мРНК, что позволяет изучать функции трансляционного контроля при развитии мозга. Этот метод является простым и недорогим подходом, чтобы сделать градиенты сахарозы и оценить полисомную фракциотацию.
В этом протоколе он используется для анализа развивающейся коры мыши. Тем не менее, он может быть легко адаптирован для изучения других систем. Начните с разбавления 2,2 молярной сахарозы, чтобы подготовить шесть градиентов 10-50% сахарозы.
Заполните 30 миллилитров шприц с примерно 16 миллилитров 10%сахарозы, поместите его на шприц насоса и подключить его к игле. Убедитесь, что в шприце, трубе или игле нет пузырьков воздуха, и протрите кончик иглы, чтобы удалить остаточный раствор. Перемести моторизованную сцену так, чтобы кончик иглы касался центра трубки внизу.
Установите шприц-насос до скорости потока в два миллилитров в минуту для объема 2,3 миллилитров. После дозирования 2,3 миллилитров 10% раствора сахарозы, двигаться вниз моторизованной стадии и повторить процесс для всех шести градиентов. Затем добавьте 20%sucrose раствор в нижней части труб, а затем 30, 40 и 50%Collect CD1 эмбрионов мыши в эмбриональный день 12 и поместите их в 10 сантиметров пластины, содержащей ледяной HBSS на льду.
Под областью вскрытия перенесите один эмбрион на шестиметровую пластину, содержащую ледяной HBSS. Используйте 21 до 23 иглы датчика, чтобы исправить положение головы, проникая через глаза под углом 45 градусов и применить силу, чтобы убедиться, что иглы закреплены на пластине. Используйте номер пять типсов, чтобы удалить кожу и череп, работающих от середины до сторон, а затем сократить обонятельные луковицы и удалить околис подвергать корковых тканей.
Используйте изогнутые типсы, чтобы разрезать корковые ткани на два-три миллилитра нейробазальной среды на льду. Вытяните ткани из разных эмбрионов по мере необходимости. Ткани от восьми до 10 эмбрионов обычно дают около 200 микрограммов общей РНК.
Добавьте циклохексимид в нейробазную среду с расчлененными тканями до конечной концентрации 100 микрограмм на миллилитр и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Центрифуга ткани на 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта. Вымойте ткани дважды с ледяной PBS дополнен 100 микрограммов на миллилитр циклохексимида.
Добавьте 500 микролитров буфера клеточного лиза, дополненного четырьмя микролитров ингибитора RNase и пипетки вверх и вниз, чтобы повторно использовать ткани. Используйте инсулиновую иглу, чтобы аккуратно подставить ткань. Затем инкубировать на льду в течение 10 минут с кратким вихрем каждые две-три минуты.
После инкубации центрифуга лизировать при 2000 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и перенести супернатант в новую центрифугу на льду. Повторите этот процесс еще раз центрифугирования при 13 000 х г. После переноса супернатанта в новую центрифугу на льду, измерьте концентрацию РНК в лиссате ткани с помощью спектрофотометра UV-Vis.
Загрузите образцы поверх градиентов сахарозы, медленно распределяя лизат к стенкам ультрацентрифугных труб. Аккуратно поместите градиенты сахарозы в ведра и ультрацентрифугировать образцы на 190 000 х г и четыре градуса по Цельсию в течение 90 минут. Поместите пустую ультрацентрифугную трубку на трубчатый пирсинг и аккуратно проникните в трубку иглой со дна.
Заполните 30 миллилитров шприц с 25 миллилитров 60% сахарозы погони решения. Затем осторожно нажмите шприц так, что решение погони заполняет пустую трубку и проходит через 254 нанометровый УФ-монитор, чтобы установить базовый уровень для обнаружения. Нажмите автоматический ноль на УФ-монитор, чтобы зарегистрировать базовый уровень для обнаружения, а затем нажмите Play на программное обеспечение, чтобы начать запись.
Как только система установит базовый уровень, приохтять запись на программное обеспечение и отказаться от решения погони, убедившись, что не остаточный решение погони остается в системе. Загрузите одну пробную трубку на трубчатый пирсинг и аккуратно проникните в трубку иглой со дна. Начните запись на программное обеспечение, убедитесь, что Есть нет пузырьков воздуха в линии.
Затем запустите шприц насос и сборщик фракций для сбора полисомных фракций, установив дробитель до 30 секунд. Соберите фракции в 1,5 миллилитровые трубки. Корковой лизат, содержащий РНК, извлеченную из восьми эмбрионов, был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций.
Пики поглощения УФ на 254 нанометров определили фракции, содержащие 40S подразделение 60S и моносомы и полисомы 80S. Анализ фракций западной помаркой для большого рибосомного подразделения Rpl10 показал его присутствие в моносомах и полисомах 60S. В отличие от этого, цитоплазмические белки, Gapdh и Csde1, не были связаны с рибосомами, но были обогащены фракциями, содержащими свободную РНК.
В соответствии с разделением белков на различные фракции, Gapdh и sox2 mRNAs были сильно обогащены фракциями, содержащими тяжелые полисомы, что свидетельствует о том, что эти мРНК эффективно переводятся в развивающаяся кору. В отличие от этого, rpl7 и rpl35 mRNAs были обогащены фракцией, содержащей моносомы, что свидетельствует о репрессированном переводе. Чтобы получить воспроизводимые результаты, важно поддерживать консистенцию в принятии градиентов сахарозы.
Шприц насосы должны быть использованы для извлечения сахарозы. Во время фракционации и сбора проб, важно мыть систему с RNase-свободной водой. Это уменьшает остатки сахарозы, оставшиеся от предыдущего образца.
Этот метод может быть использован для оценки трансляционного состояния мРНК в различных тканях. Используя платформу, можно получить согласованные градиенты для поликомного профилирования, что обеспечивает недорогое решение для этого классического и полезного метода.
