La régulation translationnelle joue un rôle important dans le développement du cerveau. Le profilage polysome fournit un outil utile et puissant pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, ce qui permet d’examiner les fonctions de contrôle translationnel pendant le développement du cerveau. Cette méthode est une approche facile et peu coûteux pour faire des gradients de saccharose et évaluer la fractionnement polysome.
Dans ce protocole, il est utilisé pour analyser le cortex de la souris en développement. Cependant, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres systèmes. Commencez par diluer 2,2 saccharose molaire pour préparer six gradients de saccharose de 10 à 50 %.
Remplissez une seringue de 30 millilitres d’environ 16 millilitres de saccharose à 10 %, placez-la sur la pompe à seringues et connectez-la à l’aiguille. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue, le tube ou l’aiguille, et essuyez le bout de l’aiguille pour enlever toute solution résiduelle. Déplacez le stade motorisé vers le haut de telle sorte que la pointe de l’aiguille touche le centre du tube au fond.
Réglez la pompe à seringues à une vitesse d’écoulement de deux millilitres par minute pour un volume de 2,3 millilitres. Après avoir distribué 2,3 millilitres de solution de saccharose à 10 %, descendez le stade motorisé et répétez le processus pour les six gradients. Ajoutez ensuite une solution de saccharose de 20 % au fond des tubes suivie de 30, 40 et 50 % recueillez des embryons de souris CD1 au jour embryonnaire 12 et placez-les dans une plaque de 10 centimètres contenant du HBSS glacé sur la glace.
Sous la portée de dissection, transférer un embryon dans une plaque de six centimètres contenant du HBSS froid comme glace. Utilisez des aiguilles de calibre 21 à 23 pour fixer la position de la tête en pénétrant à travers les yeux à un angle de 45 degrés et appliquez une force pour vous assurer que les aiguilles sont fixées sur la plaque. Utilisez le nombre cinq forceps pour enlever la peau et le crâne travaillant du milieu aux côtés, puis coupez les ampoules olfactives et enlevez les méninges pour exposer les tissus corticals.
Utilisez des forceps incurvés pour couper les tissus corticals en deux à trois millilitres de milieu neurobasal sur la glace. Tirez les tissus de différents embryons au besoin. Les tissus de huit à dix embryons donnent habituellement environ 200 microgrammes d’ARN total.
Ajouter le cycloheximide au milieu neurobasal avec les tissus disséqués à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger le tissu à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le supernatant. Lavez les tissus deux fois avec du PBS glacé complété par 100 microgrammes par cycloheximide millilitre.
Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse cellulaire complétés par quatre microlitres d’inhibiteur de la RNase et pipette de haut en bas pour résuspendre le tissu. Utilisez une aiguille à insuline pour lyser doucement le tissu. Puis incuber sur la glace pendant 10 minutes avec un bref vortex toutes les deux à trois minutes.
Après l’incubation, centrifuger le lysate à 2000 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace. Répétez ce processus une fois de plus en centrifugant à 13 000 x g. Après avoir transféré le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace, mesurez la concentration d’ARN dans le lysate tissulaire à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.
Chargez les échantillons sur les gradients de saccharose en distribuant lentement le lysate aux parois des tubes d’ultracentrifugeuse. Placez doucement les gradients de saccharose dans les seaux et ultracentrifugez les échantillons à 190 000 x g et quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Placez un tube d’ultracentrifugeuse vide sur le perceur de tube et pénètrez doucement le tube avec l’aiguille du fond.
Remplissez une seringue de 30 millilitres avec 25 millilitres de solution de chasse au saccharose à 60 %. Appuyez ensuite doucement sur la seringue de sorte que la solution de chasse remplit le tube vide et passe par le moniteur UV de 254 nanomètres pour définir la ligne de base pour la détection. Appuyez sur l’auto zéro sur le moniteur UV pour enregistrer une ligne de base pour la détection, puis appuyez sur Lire sur le logiciel pour commencer l’enregistrement.
Une fois que le système établit une ligne de base, mettre en pause l’enregistrement sur le logiciel et rétracter la solution de poursuite, en s’assurant qu’aucune solution de poursuite résiduelle reste dans le système. Chargez un tube d’échantillon sur le perceur de tube et pénètrez doucement le tube avec l’aiguille du fond. Commencez à enregistrer sur le logiciel, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la ligne.
Ensuite, démarrez la pompe à seringues et le collecteur de fractions pour recueillir les fractions polysome, en fixant le fractionneur à 30 secondes. Recueillir les fractions en tubes de 1,5 millilitre. Le lysate cortical contenant de l’ARN tiré de huit embryons a été séparé par un gradient de saccharose en 12 fractions.
Les pics d’absorption uv à 254 nanomètres ont identifié des fractions contenant le sous-unité 40S 60S et le monosome et les polysomes 80S. L’analyse des fractions par tache occidentale pour le grand sous-unité ribosomal Rpl10 a montré sa présence dans les monosomes et les polysomes subunit 60S. En revanche, les protéines cytoplasmiques, Gapdh et Csde1, n’ont pas été associées aux ribosomes, mais ont été enrichies en fractions contenant l’ARN libre.
Conformément à la séparation des protéines en différentes fractions, gapdh et sox2 mRNAs ont été fortement enrichis dans les fractions contenant des polysomes lourds, suggérant que ces ARNM sont efficacement traduits dans le cortex en développement. En revanche, les arNR rpl7 et rpl35 ont été enrichis dans la fraction contenant des monosomes, suggérant la traduction réprimée. Pour obtenir des résultats reproductibles, il est important de maintenir la cohérence dans la fabrication des gradients de saccharose.
Les pompes à seringues doivent être utilisées pour éjecter le saccharose. Lors de la fractionnement et de la collecte d’échantillons, il est important de laver le système avec de l’eau sans RNase. Cela réduit tout saccharose résiduel restant de l’échantillon précédent.
Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’état translationnel des ARNR dans divers tissus. À l’aide de la plate-forme, des gradients cohérents pour le profilage polysome peuvent être obtenus, ce qui fournit une solution peu coûteux pour cette technique classique et utile.
