التنظيم التحويلي يلعب دورا هاما في نمو الدماغ. التنميط المتعدد يوفر أداة مفيدة وقوية لتقييم الحالة الترجمية من مرنا، مما يجعل من الممكن لدراسة وظائف التحكم التحويلية أثناء نمو الدماغ. هذه الطريقة هي نهج سهل ومنخفض التكلفة لجعل تدرجات السكروز وتقييم الكسر المتعدد.
في هذا البروتوكول، يتم استخدامه لتحليل قشرة الماوس النامية. ومع ذلك، يمكن تكييفها بسهولة لدراسة النظم الأخرى. تبدأ بتخفيف 2.2 السكروز الضرس لإعداد ستة 10 إلى 50٪ تدرجات السكروز.
ملء حقنة 30 ملليلتر مع ما يقرب من 16 ملليلتر من السكروز 10٪، ووضعها على مضخة حقنة وربطها إلى الإبرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة أو الأنابيب أو الإبرة، ومسح طرف الإبرة لإزالة أي محلول متبقي. تحريك المرحلة الآلية حتى بحيث طرف الإبرة يمس مركز الأنبوب في الجزء السفلي.
تعيين مضخة حقنة لمعدل تدفق من اثنين من ملليلتر في الدقيقة الواحدة لحجم 2.3 ملليلتر. بعد الاستغناء عن 2.3 ملليلتر من محلول السكروز 10٪، انتقل إلى أسفل المرحلة الآلية وتكرار العملية لجميع التدرجات الستة. ثم أضف محلول السكروز بنسبة 20٪ إلى الجزء السفلي من الأنابيب يليه 30 و 40 و 50٪ جمع أجنة الفئران CD1 في اليوم الجنيني 12 ووضعها في لوحة 10 سم تحتوي على HBSS الجليد الباردة على الجليد.
تحت نطاق التشريح، نقل جنين واحد إلى لوحة ستة سنتيمترات تحتوي على HBSS الجليد الباردة. استخدام الإبر قياس 21-23 لإصلاح موقف الرأس عن طريق اختراق من خلال العينين في زاوية 45 درجة وتطبيق قوة للتأكد من الإبر ثابتة على لوحة. استخدام ملقط رقم خمسة لإزالة الجلد والجمجمة تعمل من الوسط إلى الجانبين، ثم قطع المصابيح الشمية وإزالة السحايا لفضح الأنسجة القشرية.
استخدام ملقط منحني لقطع الأنسجة القشرية إلى 2-3 ملليلتر من المتوسط العصبي على الجليد. سحب الأنسجة من أجنة مختلفة حسب الحاجة. الأنسجة من ثمانية إلى 10 أجنة تعطي عادة ما يقرب من 200 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
إضافة سيكلوهيكسيميد إلى الوسط العصبي القاعدي مع الأنسجة تشريح إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. طرد الأنسجة في 500 × ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant. غسل الأنسجة مرتين مع الجليد البارد PBS تكملها مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر سيكلوهيكسيميد.
إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية تكملها مع أربعة ميكرولترات من مثبطات RNase وماصة صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق الأنسجة. استخدم إبرة الأنسولين لتسلي الأنسجة برفق. ثم تحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق مع دوامة قصيرة كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
بعد الحضانة، طرد المركزية في lysate 2000 x ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية ونقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي جديد على الجليد. كرر هذه العملية مرة أخرى الطرد المركزي في 13، 000 x ز. بعد نقل الناطور إلى أنبوب طرد مركزي جديد على الجليد ، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي في الأنسجة باستخدام مطياف UV-Vis.
تحميل العينات على رأس التدرجات السكروز عن طريق الاستغناء ببطء lysate إلى جدران أنابيب الطرد الفائق. ضع تدرجات السكروز برفق في الدلاء واطرد العينات بسرعة 190 و000 × ز وأربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. ضع أنبوب طرد مركزي فارغ على مثقب الأنبوب واخترق الأنبوب برفق بواسطة الإبرة من الأسفل.
ملء حقنة 30 ملليلتر مع 25 ملليلتر من محلول مطاردة السكروز 60٪. ثم اضغط بلطف على الحقنة بحيث يملأ محلول المطاردة الأنبوب الفارغ ويمر عبر شاشة الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر لتعيين خط الأساس للكشف. اضغط على الصفر التلقائي على شاشة الأشعة فوق البنفسجية لتسجيل خط أساس للكشف، ثم اضغط على تشغيل على البرنامج لبدء التسجيل.
بمجرد أن يضع النظام خط الأساس ، وقفة تسجيل على البرنامج والتراجع عن حل مطاردة ، والتأكد من أن أي حل مطاردة المتبقية لا يزال في النظام. تحميل أنبوب عينة واحدة على أنبوب مثقب واختراق بلطف أنبوب مع الإبرة من أسفل. بدء التسجيل على البرنامج، تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الخط.
ثم بدء مضخة حقنة وجامع الكسور لجمع كسور متعددة، ووضع الكسر إلى 30 ثانية. جمع الكسور في أنابيب 1.5 ملليلتر. تم فصل الليزات القشرية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي التي تم سحبها من ثمانية أجنة عن طريق تدرج السكروز إلى 12 كسرا.
حددت قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر كسور تحتوي على وحدة فرعية 60S 40S و 80S أحادية وبوليسوم. أظهر تحليل الكسور بواسطة البقعة الغربية للوحدات الفرعية الريبوسومية الكبيرة Rpl10 وجودها في أحاديات وبوليسومات 60S الفرعية. في المقابل، لم تكن البروتينات السيتوبلازمية، Gapdh و Csde1، مرتبطة بالريبوسومات، ولكنها كانت غنية في كسور تحتوي على الحمض النووي الريبي الحر.
بما يتفق مع فصل البروتينات في كسور مختلفة، كانت جابد وsox2 mRNAs غنية للغاية في الكسور التي تحتوي على البوليسومات الثقيلة، مما يشير إلى أن هذه الرناس تترجم بكفاءة في القشرة النامية. وعلى النقيض من ذلك، تم إثراء rpl7 و rpl35 mRNAs في الكسر الذي يحتوي على أحاديات، مما يشير إلى ترجمة مكبوتة. للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ، من المهم الحفاظ على الاتساق في صنع تدرجات السكروز.
يجب استخدام مضخات الحقن لإخراج السكروز. أثناء الكسر وجمع العينات ، من المهم غسل النظام بالماء الخالي من RNase. وهذا يقلل من أي السكروز المتبقية من العينة السابقة.
يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الحالة الترجمية للرنانات الريبية في مختلف الأنسجة. باستخدام النظام الأساسي ، يمكن الحصول على تدرجات متسقة للتنميط المتعدد ، مما يوفر حلا منخفض التكلفة لهذه التقنية الكلاسيكية والمفيدة.
