Transkrasyon düzenlemesi beyin gelişiminde önemli bir rol oynar. Polisome profilleme, mRNA'nın çevirisel durumunu değerlendirmek için yararlı ve güçlü bir araç sağlar ve beyin gelişimi sırasında çevirisel kontrol fonksiyonlarının incelenmesini mümkün hale getirir. Bu yöntem, sakkaroz gradyanları yapmak ve polizom fraksiyonasyonunu değerlendirmek için kolay ve düşük maliyetli bir yaklaşımdır.
Bu protokolde, gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için kullanılır. Ancak, diğer sistemleri incelemek için kolayca uyarlanabilir. Altı 10 ila 50% sakkaroz gradyanları hazırlamak için 2.2 azı dişi sakkaroz seyrelterek başlayın.
30 mililitrelik bir şırıngayı yaklaşık 16 mililitre% 10 sakkarozla doldurun, şırınga pompasına yerleştirin ve iğneye bağlayın. Şırıngada, tüpte veya iğnede hava kabarcıkları olmadığından emin olun ve artık çözeltiyi çıkarmak için iğnenin ucunu silin. Motorlu sahneyi, iğnenin ucu alttaki tüpün ortasına değdirene kadar yukarı taşıyın.
Şırınd pompasını 2,3 mililitrelik bir hacim için dakikada iki mililitrelik bir akış hızına ayarlayın. % 10 sakkaroz çözeltisinin 2,3 mililitresini dağıttıktan sonra, motorlu aşamadan aşağı hareket edin ve altı gradyan için işlemi tekrarlayın. Daha sonra tüplerin altına% 20 sakkaroz çözeltisi ekleyin ve ardından% 30, 40 ve% 50 Embriyonik gün 12'de CD1 fare embriyolarını toplayın ve buz üzerinde buz gibi HBSS içeren 10 santimetrelik bir plakaya yerleştirin.
Diseksiyon kapsamı altında, bir embriyoyu buz gibi HBSS içeren altı santimetrelik bir plakaya aktarın. 45 derecelik bir açıyla gözlerden geçerek başın konumunu sabitlemek için 21 ila 23 ölçer iğne kullanın ve iğnelerin plakaya sabit olduğundan emin olmak için bir kuvvet uygulayın. Ortadan yanlara çalışan deriyi ve kafatasını çıkarmak için beş numaralı tokmakları kullanın, ardından koku ampullerini kesin ve kortikal dokuları açığa çıkarmak için menenjileri çıkarın.
Kortikal dokuları buz üzerinde iki ila üç mililitre nörobakal ortama kesmek için kavisli tokmaklar kullanın. Dokuları gerektiği gibi farklı embriyolardan çekin. Sekiz ila 10 embriyodan dokular genellikle yaklaşık 200 mikrogram toplam RNA verir.
Parçalanmış dokularla nörobakal ortama mililitre başına 100 mikrogramlık son konsantrasyona sikloeximide ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 500 x g'daki dokuyu dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve üst saltantı atın. Dokuları mililitre sikloeximide başına 100 mikrogram ile desteklenmiş buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.
Dokuyu yeniden canlandırmak için dört mikrolitre RNaz inhibitörü ve pipet ile desteklenmiş 500 mikrolitre hücre liziz tamponu ekleyin. Dokuyu hafifçe imsilmek için bir insülin iğnesi kullanın. Daha sonra her iki ila üç dakikada bir kısa girdap ile 10 dakika buzda kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, 2000 x g'daki lisatı dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu işlemi 13.000 x g'da bir kez daha santrifüjleme tekrarlayın. Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak doku lisatındaki RNA konsantrasyonunu ölçün.
Numuneleri, lisatı ultracentrifuge tüplerinin duvarlarına yavaşça dağıtarak sakkaroz gradyanlarının üzerine yükleyin. Sakkaroz gradyanlarını kovalara hafifçe yerleştirin ve numuneleri 90 dakika boyunca 190, 000 x g ve dört santigrat derecede ultrasantrifüjleyin. Tüp delicisine boş bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin.
30 mililitrelik bir şırınnayı 25 mililitre%60 sakkaroz kovalama çözeltisi ile doldurun. Daha sonra şırınna yavaşça bastırın, böylece kovalama çözeltisi boş tüpü doldurur ve algılama için taban çizgisini ayarlamak için 254 nanometre UV monitöründen geçer. Algılama için bir taban çizgisi kaydetmek için UV monitöründe otomatik sıfıra basın, ardından kayda başlamak için yazılımda Oynat'a basın.
Sistem bir taban çizgisi oluşturduktan sonra, yazılımdaki kaydı duraklatın ve sistemde artık bir kovalamaca çözümü kalmadığından emin olarak chase çözümünü geri alın. Tüp delicisine bir örnek tüp yükleyin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin. Yazılıma kaydetmeye başlayın, hatta hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
Daha sonra şırındıcı pompayı ve kesir toplayıcıyı çalıştırarak polizom fraksiyonlarını toplayın, fraksiyonörü 30 saniyeye ayarlayın. Kesirleri 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Sekiz embriyodan çekilen RNA içeren kortikal lisat, sakkaroz gradyanı ile 12 fraksiyona ayrıldı.
254 nanometredeki UV absorbansının zirveleri, 40S alt birliği 60S alt birliğini ve 80S monozom ve polisomelerini içeren fraksiyonları tanımladı. Büyük ribozomal alt ünit Rpl10 için Batı blotunun fraksiyonlarının analizi, 60S alt birliği monozom ve poliomlarında varlığını gösterdi. Buna karşılık, sitoplazmik proteinler, Gapdh ve Csde1, ribozomlarla ilişkili değildi, ancak serbest RNA içeren fraksiyonlarda zenginleştirilmişti.
Proteinlerin farklı fraksiyonlarda ayrılmasıyla tutarlı olarak, Gapdh ve sox2 mRNA'ları ağır poliomlar içeren fraksiyonlarda yüksek oranda zenginleştirilmiştir, bu da bu mRNA'ların gelişmekte olan kortekste verimli bir şekilde çevrildiğini düşündürmektedir. Buna karşılık, rpl7 ve rpl35 mRNA'lar monozom içeren fraksiyonda zenginleştirildi ve bastırılmış çeviri önerildi. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sakkaroz gradyanlarının yapımında tutarlılığı korumak önemlidir.
Şırınd pompaları sakkarodu çıkarmak için kullanılmalıdır. Fraksiyonasyon ve numune toplama sırasında, sistemin RNase içermeyen su ile yıkanması önemlidir. Bu, önceki örnekten kalan artık sakkarozları azaltır.
Bu yöntem, çeşitli dokulardaki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Platformu kullanarak, bu klasik ve kullanışlı teknik için düşük maliyetli bir çözüm sağlayan polisome profilleme için tutarlı degradeler elde edilebilir.
