Dieses Protokoll demonstriert die neue Trennung von Makrophagen des mittleren Herzens und die Transplantation in erwachsene Mäuse, was ein freizügiger Weg zur Förderung der Herzreparatur sein könnte. Die Implikationen dieser Technik können auf das Herzregenerationsfeld ausgedehnt werden. Beginnen Sie mit der Vorkühlung der Bronze-Bedienplattform über Nacht bei 20 Grad Celsius.
Nehmen Sie die betäubte Maus aus dem Eiskasten und legen Sie sie auf die Plattform. Verankern Sie die Maus in Rückenlage mit medizinischem Klebeband. Legen Sie die Bedienplattform mit der Maus unter ein Stereoskop und desinfizieren Sie die Brust der Maus mit einem mit Betadin und 70% Alkohol getränkten Vorbereitungspad.
Schneiden Sie die Haut mit einem Zentimeter Schnitt im vierten Interkostalbereich der Brusthöhle ein und trennen Sie die Interkostalmuskulatur mit einer mikrochirurgischen Schere, bis das Herz zugänglich ist. Drücken Sie abwechselnd Brust und Bauch mit Hilfe einer Zweizette, bis das Herz ohne mechanische Beschädigung aus der Brust heraus äußert ist. Setzen Sie die Rippen unter und über dem kleinen Schnitt als natürliche Fixierung, um das Herz zu immobilisieren, lokalisieren Sie die Spitze des linken Ventrikels und schneiden Sie mit Ihrer Iridektomieschere einen Durchmesser von einem Millimeter ventrikulärem Spitzengewebe.
Bestätigen Sie, dass die linke Kammer freigelegt ist und zu sickern beginnt. Drücken Sie das Herz mit einem Wattestäbchen sanft zurück in die Brusthöhle, nähen Sie Muskeln, Rippen und Haut mit acht x null Prolenennähten und reinigen Sie die Maus nach der Operation gründlich. Übertragen Sie die Maus von der Bedienplattform auf eine 37-Grad-Heizdecke, um den Körper unmittelbar nach der Operation aufzuwärmen.
Bestätigen Sie die Antibiose der Maus, indem Sie auf die Anzeichen einer spontanen Atmungswiederherstellung, hautfarbenen Wechsel von blass zu rosa und Bewegung der Gliedmaßen achten. Bringen Sie die operierte Maus zurück zu ihrer Mutter, sobald sie sich erholt hat. Mischen Sie die operierte Maus und die Nistmaterialien der Mutter, falls erforderlich.
Ernten Sie das Herz einer eingeschläferten NEONATAL-CX3-CR1-GFP-Maus einen Tag nach der apikalen Resektion und tauchen Sie es in eine 10 Zentimeter große Schüssel mit PBS. Schneiden Sie die Gefäße und das verbleibende Bindegewebe von den Ventrikeln weg. Schneiden Sie den aurikulären Blinddarm und den Ausflusstrakt vom Herzen weg.
Nachdem das Herz aufhört zu schlagen, schneiden Sie das Herz in ein bis zwei Kubikmillimeter in Phosphatsalzpuffer mit einer mikrochirurgischen Schere in ein bis zwei Kubikmillimeter. Geben Sie sie in ein Röhrchen mit 2,5 Millilitern vorgewärmter Enzymmischung und schließen Sie das Röhrchen fest. Kehren Sie die Röhre um und legen Sie sie mit der Kappe nach unten, dann führen Sie das Neonatal Heart Dissociation-Programm aus.
Lösen Sie das Rohr vom Dissoziator, nachdem das Programm abgeschlossen ist. 7,5 Milliliter 1x DMEM mit 10% FBS in die Röhre geben. Filtern und übertragen Sie die Suspension in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 mal G für fünf Minuten. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Blutzelllyselösung und inkubieren Sie es zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. 5 bis 10 Milliliter Phosphatsalzpuffer in die Suspension geben und fünf Minuten lang bei 300 mal G zentrifugieren.
Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter DMEM mit 10% FBS erneut und sortieren Sie dann GFP-positive neonatale Herzmakrophagen per Fax. Sortieren Sie Makrophagen in ein steriles Röhrchen mit 500 Millilitern DMEM mit 10% FBS. Zählen Sie die GFP-positiven Makrophagen und suspendieren Sie sie in DMEM mit 10% FBS bei der Konzentration von einer Million Makrophagen pro 200 Milliliter DMEM für die spätere Injektion.
Neonatale herzdiale Makrophagen wurden in das myokardinfarktierte erwachsene Mausherz injiziert und die Wirksamkeit der proliferativen Kardiomyozyten wurde durch immunfluoreszierende Färbung bestätigt. Statistische Analysen zeigen, dass die Kardiomyozytenproliferation nach einer Makrophagentransplantation zunimmt. Echokardiogrammbilder zeigen die Herzfunktion bei einer erwachsenen Maus einen Monat nach einem Myokardinfarkt.
Die Herzfunktion wird nach einer Makrophagentransplantation verbessert. Die Masse in der Färbung zeigt, dass der infarkte Bereich bei einer erwachsenen Maus einen Monat nach dem Myokardinfarkt nach der neonatalen Herzmakrophagentransplantation bemerkenswert reduziert war. Die neonatale herzmakrale Makrophagentransplantation könnte eine Förderstrategie zur Förderung der Herzregeneration des Erwachsenen im Mund sein.
Dieses Protokoll hilft Forschern, regenerative Anwendungsentwicklung zu verfolgen und den Herzregenerationsmechanismus zu erforschen.
