Este protocolo demonstra a separação de macrófagos cardíacos médios e o transplante em camundongos adultos, o que pode ser uma maneira permissiva de promover a reparação cardíaca. As implicações desta técnica podem ser estendidas ao campo de regeneração cardíaca. Comece pré-resfriamento da plataforma operacional bronze durante a noite a 20 graus Celsius.
Tire o rato anestesiado da geladeira e coloque-o na plataforma. Ancore o mouse em uma posição supina usando fita adesiva médica. Coloque a plataforma de operação com o mouse sob um estereoscópio, e desinfete o baú do mouse usando uma almofada de preparação encharcada com betadina e 70% de álcool.
Incise a pele com um corte de um centímetro na quarta área intercostal da cavidade torácica, e separe os músculos intercostais usando uma tesoura microcirúrgica até que o coração seja acessado. Pressione alternadamente o peito e o abdômen com a ajuda de dois fórceps até que o coração seja exteriorizado para fora do peito sem qualquer dano mecânico. Coloque as costelas abaixo e acima da pequena incisão como uma fixação natural para imobilizar o coração, localizar o ápice do ventrículo esquerdo e cortar um milímetro de diâmetro de tecido ápice ventricular usando sua tesoura de iridectomia.
Confirme se a câmara ventricular esquerda está exposta e começa a escorrer. Pressione suavemente o coração de volta para a cavidade torácica usando um cotonete de algodão, suturar os músculos, costelas e pele usando oito por zero suturas de prolene e limpe o rato completamente após a operação. Transfira o mouse da plataforma operacional para um manta de aquecimento de 37 graus para aquecer o corpo imediatamente após a operação.
Confirme a antibiose do camundongo observando os sinais de restauração espontânea da respiração, mudança de cor da pele de pálido para rosa e movimento dos membros. Leve o rato operado de volta para sua mãe uma vez que ele se recupere. Misture o rato operado e são materiais de aninhamento da mãe, se necessário.
Colher o coração de um rato CX3-CR1-GFP neonatal eutanizado um dia após a ressecção apical e imergi-lo em um prato de 10 centímetros com PBS. Corte os vasos e o tecido conjuntivo restante longe dos ventrículos. Corte o apêndice auricular e o trato de saída do coração.
Depois que o coração parar de bater corte o coração em pedaços cúbicos de um a dois milímetros cúbicos em tampão salino fosfato usando tesoura microcirúrgica. Transfira-os para um tubo contendo 2,5 mililitros de mistura de enzimas pré-aques e feche firmemente o tubo. Inverta o tubo e coloque-o com a tampa para baixo, em seguida, execute o programa de Dissociação Cardíaca Neonatal.
Retire o tubo do dissociador após o programa ser concluído. Adicione 7,5 mililitros de 1x DMEM com 10% de FBS ao tubo. Filtre e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Centrifugar a suspensão da célula a 300 vezes G por cinco minutos. Suspenda a pelota celular em um mililitro da solução de lise celular e incubar por dois minutos à temperatura ambiente. Adicione 5 a 10 mililitros de tampão salino fosfato à suspensão e centrífuga a 300 vezes G por cinco minutos.
Suspenda novamente a pelota celular em um mililitro de DMEM com 10% FBS, depois classifique macrófagos cardíacos neonatais positivos de GFP por fax. Classifique macrófagos em um tubo estéril contendo 500 mililitros de DMEM com 10% de FBS. Conte os macrófagos positivos do GFP e suspenda-os no DMEM com 10% de FBS na concentração de um milhão de macrófagos por 200 mililitros de DMEM para injeção posterior.
Macrófagos cardíacos neonatais foram injetados no coração do camundongo adulto infartado do miocárdio e a eficiência dos cardiomiócitos proliferativos foi confirmada pela coloração imunofluorescente. A análise estatística mostra que a proliferação de cardiomiócitos aumenta após o transplante de macrófago. Imagens de ecocardiograma mostram a função cardíaca em um rato adulto um mês após o infarto do miocárdio.
A função cardíaca é aprimorada após o transplante de macrófago. A massa na coloração mostra que a área infarta em um camundongo adulto um mês após o infarto do miocárdio foi notavelmente reduzida após o transplante de macrófago cardíaco neonatal. O transplante de macrófago cardíaco neonatal pode ser uma estratégia de promoção para promover a regeneração do coração bucal adulto.
Este protocolo ajuda os pesquisadores a buscar o desenvolvimento de aplicações regenerativas e explorar o mecanismo de regeneração cardíaca.
