Ce protocole démontre la séparation de nouveaux macrophages cardiaques moyens et la transplantation chez des souris adultes, ce qui pourrait être un moyen permissif de favoriser la réparation cardiaque. Les implications de cette technique peuvent être étendues au champ de régénération cardiaque. Commencez par pré-refroidir la plate-forme d’exploitation en bronze pendant la nuit à 20 degrés Celsius.
Sortez la souris anesthésisée de la glacière et mettez-la sur la plate-forme. Ancrez la souris en position couchée à l’aide de ruban adhésif médical. Placez la plate-forme d’opération avec la souris sous un stéréoscope et désinfectez la poitrine de la souris à l’aide d’un tampon de préparation imbibé de bétadine et d’alcool à 70%.
Inciser la peau avec une coupe d’un centimètre à la quatrième zone intercostale de la cavité thoracique et séparer les muscles intercostaux à l’aide de ciseaux microchirurgicaux jusqu’à ce que le cœur soit accessible. Appuyez alternativement sur la poitrine et l’abdomen à l’aide de deux pinces jusqu’à ce que le cœur soit extériorisé hors de la poitrine sans aucun dommage mécanique. Placez les côtes en dessous et au-dessus de la petite incision comme une fixation naturelle pour immobiliser le cœur, localisez l’apex du ventricule gauche et coupez un millimètre de diamètre de tissu apex ventriculaire à l’aide de vos ciseaux d’iridctomie.
Confirmez que la chambre ventriculaire gauche est exposée et commence à suinter. Pressez doucement le cœur dans la cavité thoracique à l’aide d’un coton-tige, suturez les muscles, les côtes et la peau à l’aide de sutures de prolène huit par zéro et nettoyez soigneusement la souris après l’opération. Transférez la souris de la plate-forme d’exploitation vers une couverture chauffante à 37 degrés pour réchauffer le corps immédiatement après l’opération.
Confirmez l’antibiose de la souris en observant les signes de restauration spontanée de la respiration, le changement de couleur de la peau de pâle à rose et le mouvement des membres. Ramenez la souris opérée à sa mère une fois qu’elle a récupéré. Mêlez la souris opérée et le matériel de nidification de sa mère, si nécessaire.
Récoltez le cœur d’une souris CX3-CR1-GFP néonatale euthanasiée un jour après la résection apicale et immergez-le dans un plat de 10 centimètres avec du PBS. Coupez les vaisseaux et le tissu conjonctif restant loin des ventricules. Coupez l’appendice auriculaire et le tractus d’écoulement loin du cœur.
Une fois que le cœur cesse de battre, coupez le cœur en morceaux d’un à deux millimètres cubes dans un tampon salin de phosphate à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Transférez-les dans un tube contenant 2,5 millilitres de mélange d’enzymes préchauffé et fermez hermétiquement le tube. Inversez le tube et placez-le avec le capuchon vers le bas, puis exécutez le programme de dissociation cardiaque néonatale.
Détachez le tube du dissociateur une fois le programme terminé. Ajouter 7,5 millilitres de 1x DMEM avec 10% FBS au tube. Filtrer et transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Centrifuger la suspension de la cellule à 300 fois G pendant cinq minutes. Re-suspendre la pastille cellulaire dans un millilitre de solution de lyse des cellules sanguines et incuber pendant deux minutes à température ambiante. Ajouter 5 à 10 millilitres de tampon salin phosphate à la suspension et centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes.
Re-suspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de DMEM avec 10% FBS, puis triez les macrophages cardiaques néonatals GFP positifs par fax. Trier les macrophages dans un tube stérile contenant 500 millilitres de DMEM avec 10% FBS. Compter les macrophages GFP positifs et les suspendre à nouveau dans le DMEM avec 10% FBS à la concentration d’un million de macrophages par 200 millilitres de DMEM pour une injection ultérieure.
Des macrophages cardiaques néonatals ont été injectés dans le cœur de souris adulte infarctus du myocarde et l’efficacité des cardiomyocytes prolifératifs a été confirmée par coloration immunofluorescente. L’analyse statistique montre que la prolifération des cardiomyocytes augmente après la transplantation de macrophages. Les images d’échocardiogramme montrent la fonction cardiaque chez une souris adulte un mois après l’infarctus du myocarde.
La fonction cardiaque est améliorée après une transplantation de macrophages. La masse dans la coloration montre que la zone infarctus chez une souris adulte un mois après l’infarctus du myocarde a été remarquablement réduite après la transplantation de macrophages cardiaques néonatals. La transplantation de macrophages cardiaques néonatals pourrait être une stratégie de promotion pour favoriser la régénération cardiaque de la bouche adulte.
Ce protocole aide les chercheurs à poursuivre le développement d’applications régénératives et à explorer le mécanisme de régénération cardiaque.
