이 프로토콜은 심장 검사를 촉진하는 허용 방법이 될 수 있습니다 성인 마우스로 새로운 중간 심장 대식세포 분리 및 이식을 보여줍니다. 이 기술의 의미는 심장 재생 필드로 확장 될 수있다. 먼저 하룻밤 동안 청동 작동 플랫폼을 섭씨 20도에서 미리 냉각하십시오.
마취 된 마우스를 아이스 박스에서 꺼내 플랫폼에 놓습니다. 의료 용 접착제 테이프를 사용하여 마우스를 supine 위치에 고정하십시오. 스테레오스코프 아래에 마우스로 작동 플랫폼을 넣고 베타딘과 70 %의 알코올에 담근 준비 패드를 사용하여 마우스 가슴을 소독하십시오.
가슴 구멍의 네 번째 늑간 부위에서 1센티미터 절단된 피부를 절개하고, 심장에 접근할 때까지 미세 수술 가위를 사용하여 늑간 근육을 분리합니다. 심장이 기계적 손상없이 가슴 밖으로 외부 될 때까지 두 개의 집게의 도움으로 가슴과 복부를 번갈아 누릅니다. 심장을 고정하고 왼쪽 심실의 정점을 찾고 iridectomy 가위를 사용하여 심실 정점 조직의 1 밀리미터 직경을 자르는 자연적인 고정으로 작은 절개 아래와 위에 갈비뼈를 설정합니다.
왼쪽 심실 챔버가 노출되어 스며들기 시작하는지 확인합니다. 면 봉면을 사용하여 심장을 가슴 구멍으로 부드럽게 누르고, 근육, 갈비뼈 및 피부를 봉합봉하여 8 개의 prolene 봉합사를 사용하여 작업 후 마우스를 철저히 청소하십시오. 수술 플랫폼에서 마우스를 37도 가열 담요로 옮기고 수술 직후 몸을 따뜻하게 합니다.
자발적인 호흡 회복의 징후를 관찰하여 마우스의 항바이오시스를 확인, 피부 색은 창백한에서 분홍색으로 변하고 사지의 움직임으로 변경한다. 수술된 마우스를 회복한 후 어머니에게 다시 가져가십시오. 수술 된 마우스를 섞고 필요한 경우 어머니의 중첩 재료입니다.
안락사 신생아 CX3-CR1-GFP 마우스의 심장을 수확한 후 하루 만에 PBS가 있는 10센티미터 접시에 담급다. 혈관과 남은 결합 조직을 심실에서 잘라냅니다. 심장에서 멀리 오리큘러 부록과 유출 관을 잘라.
심장 박동을 중지 한 후 미세 수술 가위를 사용하여 인산염 식염수 버퍼에 1 ~ 2 입방 밀리미터 조각으로 심장을 잘라. 예열효소 혼합물 2.5 밀리리터를 함유한 튜브로 옮기고 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 반전시키고 캡을 내려 놓고 신생아 심장 해리 프로그램을 실행합니다.
프로그램이 완료된 후 해리소에서 튜브를 분리합니다. 튜브에 10%의 FBS로 1배 DMEM의 7.5밀리리터를 추가합니다. 서스펜션을 15밀리리터 원심분리튜브로 필터링하고 전송합니다.
세포 현탁액을 300배 G로 5분간 원심분리합니다. 세포 용해 용액의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 실온에서 2 분 동안 배양하십시오. 5-10 밀리리터의 인산염 식염수 버퍼를 서스펜션에 넣고 원심분리기를 300배 G에서 5분간 첨가합니다.
10%의 FBS로 DMEM의 1밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단한 다음 GFP 양성 신생아 심장 대식세포를 팩스로 정렬합니다. 대식세포는 10%의 FBS를 갖춘 DMEM 500 밀리리터를 포함하는 멸균 튜브로 정렬합니다. GFP 양성 대식대를 계산하고 나중에 주입을 위해 DMEM의 200 밀리리터 당 백만 대식세포의 농도에서 10 %의 FBS로 DMEM에서 다시 중단하십시오.
신생아 심장 대식세포는 심근 경색 성마우스 심장에 주입되었고 증식 심근세포의 효율은 면역형성 염색에 의해 확인되었다. 통계 분석에 따르면 대식세포 이식 후 심근세포 증식이 증가한다는 것을 보여줍니다. 심초음파 이미지는 심근 경색 후 한 달 후에 성인 마우스에 있는 심장 기능을 보여줍니다.
대식세포 이식 후 심장 기능이 향상됩니다. 염색에 질량은 신생아 심장 대식세포 이식 후 심근 경색 후 한 달 후 성인 마우스의 경색 영역이 현저하게 감소되었다는 것을 보여줍니다. 신생아 심장 대식세포 이식은 성인 입 심장 재생을 촉진하는 프로모션 전략일 수 있습니다.
이 프로토콜은 연구원이 재생 응용 프로그램 개발을 추구하고 심장 재생 메커니즘을 탐구하는 데 도움이됩니다.
