Bu protokol, yeni orta kardiyak makrofajların ayrılmasını ve yetişkin farelere nakli göstermektedir, bu da kardiyak onarımı teşvik etmenin izin veren bir yolu olabilir. Bu tekniğin etkileri kalp yenilenme alanına kadar genişletilebilir. Bronz işletim platformunu 20 santigrat derecede gece boyunca önceden soğutarak başlayın.
Uyuşturulmuş fareyi buzluk kutusundan çıkar ve platforma koy. Tıbbi yapışkan bant kullanarak fareyi bir destek konumuna getirin. Fare ile çalışma platformunu stereoskop altına koyun ve betadin ve% 70 alkol ile ıslatılmış bir hazırlık pedi kullanarak fare göğsünü dezenfekte edin.
Göğüs boşluğunun dördüncü interkostal bölgesinde bir santimetre kesilmiş cildi inklüzyüne edin ve kalbe erişilene kadar mikrocerrahi makas kullanarak interkostal kasları ayırın. Alternatif olarak, kalp herhangi bir mekanik hasar olmadan göğüsten dışlanıncaya kadar iki yabanarı yardımıyla göğsüne ve karnına bastırın. Kalbi hareketsiz hale getirmek için kaburgaları küçük kesiğin altına ve üstüne doğal bir fiksasyon olarak ayarlayın, sol ventrikülün tepesini bulun ve iridektomi makasınızı kullanarak bir milimetre çapında ventrikül apeks dokusunu kesin.
Sol ventrikül odasının açıkta olduğunu ve sızmaya başladığını onaylayın. Pamuklu çubuk kullanarak kalbi yavaşça göğüs boşluğuna geri bastırın, sekize sıfır prolene dikiş kullanarak kasları, kaburgaları ve cildi dikin ve operasyondan sonra fareyi iyice temizleyin. Operasyondan hemen sonra vücudu ısıtmak için fareyi çalışma platformundan 37 derecelik bir ısıtma battaniyesine aktarın.
Spontan solunum restorasyonu, cilt renginin soluktan pembeye ve uzuvların hareketi belirtilerini gözlemleyerek farenin antibiyozunu onaylayın. Ameliyat edilen fareyi iyileştikten sonra annesine geri götürün. Ameliyat edilen fareyi katıştırın ve gerekirse annenin yuva malzemeleridir.
Apikal rezeksiyondan bir gün sonra ötenazili bir yenidoğan CX3-CR1-GFP faresinin kalbini hasat edin ve PBS ile 10 santimetrelik bir tabağa daldırin. Damarları ve kalan bağ dokusunu ventriküllerden uzak kesin. Auriküler apandisiti kesin ve çıkış yolunu kalpten uzaklaştırın.
Kalp durduktan sonra kalbi mikrocerrahi makas kullanarak fosfat salin tamponunda bir ila iki milimetreküp parçalar halinde kesin. Bunları önceden ısıtılmış 2,5 mililitre enzim karışımı içeren bir tüpe aktarın ve tüpü sıkıca kapatın. Tüpü ters çevirin ve kapağı aşağı doğru yerleştirin, sonra Yenidoğan Kalp Ayrışması programını çalıştırın.
Program tamamlandıktan sonra tüpü ayrıştırıcıdan ayırın. Tüpe %10 FBS ile 7,5 mililitre 1x DMEM ekleyin. Süspansiyonu filtreleyin ve 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın.
Hücre süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Hücre peletini bir mililitre kan hücresi liziz çözeltisinde yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın. Süspansiyona 5 ila 10 mililitre fosfat salin tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj ekleyin.
Hücre peletini %10 FBS ile bir mililitre DMEM'de yeniden askıya alın, ardından GFP pozitif yenidoğan kardiyak makrofajları faksla sıralayın. Makrofajları%10 FBS ile 500 mililitre DMEM içeren steril bir tüpe ayırın. GFP pozitif makrofajları sayın ve daha sonra enjeksiyon için 200 mililitre DMEM başına bir milyon makrofaj konsantrasyonunda% 10 FBS ile DMEM'de yeniden askıya alın.
Miyokard enfarktüslü erişkin fare kalbine yenidoğan kardiyak makrofajlar enjekte edildi ve proliferatif kardiyomiyositlerin etkinliği immünofluoresan lekeleme ile doğrulandı. İstatistiksel analizler makrofaj naklinden sonra kardiyomiyosit çoğalmasının arttığını göstermektedir. Ekokardiyogram görüntüleri miyokard enfarktüsünden bir ay sonra yetişkin bir farede kardiyak fonksiyonu gösterir.
Makrofaj naklinden sonra kardiyak fonksiyon artar. Lekelemede kitle, miyokard enfarktüsünden bir ay sonra yetişkin bir faredeki enfarktüs bölgesinin yenidoğan kardiyak makrofaj naklinden sonra önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Yenidoğan kardiyak makrofaj nakli, yetişkin ağız kalbi yenilenmesini teşvik etmek için bir teşvik stratejisi olabilir.
Bu protokol, araştırmacıların rejeneratif uygulama gelişimini sürdürmelerine ve kalp yenilenme mekanizmasını keşfetmelerine yardımcı olur.
