Questo protocollo dimostra la separazione di nuovi macrofagi cardiaci medi e il trapianto in topi adulti, che potrebbe essere un modo permissivo per promuovere la riparazione cardiaca. Le implicazioni di questa tecnica possono essere estese al campo della rigenerazione cardiaca. Inizia pre-raffreddando la piattaforma operativa in bronzo durante la notte a 20 gradi Celsius.
Prendi il mouse anestetizzato dalla ghiacciaia e mettilo sulla piattaforma. Ancorare il mouse in posizione supina utilizzando nastro adesivo medico. Metti la piattaforma operativa con il mouse sotto uno stereoscopio e disinfetta il torace del mouse usando un pad di preparazione imbevuto di betadine e alcool al 70%.
Incidere la pelle con un taglio di un centimetro nella quarta area intercostale della cavità toracica e separare i muscoli intercostali usando forbici microchirurgiche fino a quando non si accede al cuore. In alternativa premere il torace e l'addome con l'aiuto di due pinza fino a quando il cuore non è esteriorizzato fuori dal torace senza alcun danno meccanico. Impostare le costole sotto e sopra la piccola incisione come una fissazione naturale per immobilizzare il cuore, individuare l'apice del ventricolo sinistro e tagliare un diametro di un millimetro di tessuto dell'apice ventricolare usando le forbici per iridectomia.
Verificare che la camera ventricolare sinistra sia esposta e inizi a trasudare. Premere delicatamente il cuore nella cavità toracica usando un batuffolo di cotone, suturare i muscoli, le costole e la pelle usando otto suture di prolene per zero e pulire accuratamente il mouse dopo l'operazione. Trasferire il mouse dalla piattaforma operativa a una coperta riscaldante a 37 gradi per riscaldare il corpo immediatamente dopo l'operazione.
Confermare l'antibiosi del topo osservando i segni del ripristino spontaneo della respirazione, il cambiamento del colore della pelle da pallido a rosa e il movimento degli arti. Riporta il mouse operato alla sua madre una volta che si è ripreso. Mescola il mouse operato e i materiali di nidificazione della madre, se necessario.
Raccogli il cuore di un topo neonatale CX3-CR1-GFP eutanasizzato un giorno dopo la resezione apicale e immergilo in un piatto di 10 centimetri con PBS. Tagliare i vasi e il tessuto connettivo rimanente lontano dai ventricoli. Tagliare l'appendice auricolare e il tratto di deflusso lontano dal cuore.
Dopo che il cuore smette di battere, tagliare il cuore in uno o due millimetri cubi in tampone salino fosfatico usando forbici microchirurgiche. Trasferirli in un tubo contenente 2,5 millilitri di miscela enzimatica preriscaldata e chiudere ermeticamente il tubo. Invertire il tubo e posizionarlo con il cappuccio verso il basso, quindi eseguire il programma di dissociazione cardiaca neonatale.
Staccare il tubo dal dissociatore al termine del programma. Aggiungere 7,5 millilitri di 1x DMEM con 10% FBS al tubo. Filtrare e trasferire la sospensione in un tubo centrifugo da 15 millilitteri.
Centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere di due minuti il pellet cellulare in un millilitro di soluzione di lisi delle cellule del sangue e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Aggiungere da 5 a 10 millilitri di tampone salino fosfato alla sospensione e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti.
Sospendere di due anni il pellet cellulare in un millilitro di DMEM con il 10% di FBS, quindi ordinare i macrofagi cardiaci neonatali GFP positivi via fax. Ordina i macrofagi in un tubo sterile contenente 500 millilitri di DMEM con il 10% di FBS. Contare i macrofagi GFP positivi e ri-sospenderli in DMEM con 10% FBS alla concentrazione di un milione di macrofagi per 200 millilitri di DMEM per successiva iniezione.
I macrofagi cardiaci neonatali sono stati iniettati nel cuore del topo adulto infartuato del miocardio e l'efficienza dei cardiomiociti proliferativi è stata confermata dalla colorazione immunofluorescente. L'analisi statistica mostra che la proliferazione dei cardiomiociti aumenta dopo il trapianto di macrofagi. Le immagini dell'ecocardiogramma mostrano la funzione cardiaca in un topo adulto un mese dopo l'infarto del miocardio.
La funzione cardiaca è migliorata dopo il trapianto di macrofagi. La massa nella colorazione mostra che l'area infartuale in un topo adulto un mese dopo l'infarto miocardico è stata notevolmente ridotta dopo il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali. Il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali potrebbe essere una strategia di promozione per promuovere la rigenerazione del cuore della bocca adulta.
Questo protocollo aiuta i ricercatori a perseguire lo sviluppo di applicazioni rigenerative ed esplorare il meccanismo di rigenerazione del cuore.
