Этот протокол демонстрирует разделение новых средних сердечных макрофагов и трансплантацию взрослым мышам, что может быть разрешительным способом содействия восстановлению сердца. Последствия этой техники могут быть распространены на поле регенерации сердца. Начните с предварительного охлаждения бронзовой рабочей платформы в течение ночи при 20 градусах Цельсия.
Вытащенную мышь из ледяного ящика вытащенную мышь и положите на платформу. Закрепите мышь в положении лежа на спине с помощью медицинской клейкой ленты. Поместите операционную платформу с мышью под стереоскоп и продезинфицируйте сундук мыши с помощью подготовительной прокладки, пропитанной бетадином и 70% спиртом.
Разрезайте кожу с помощью одного сантиметрового разреза в четвертой межречной области грудной полости и отделите межребрачные мышцы с помощью микрохирургических ножниц до тех пор, пока к сердцу не будет доступен. Поочередно надавливать на грудную клетку и живот с помощью двух щипцов до тех пор, пока сердце не выйдет из грудной клетки без каких-либо механических повреждений. Установите ребра ниже и выше небольшого разреза в качестве естественной фиксации, чтобы обездвижить сердце, найти вершину левого желудочка и разрезать диаметр одного миллиметра ткани верхушки желудочка с помощью ножниц иридэктомии.
Подтвердите, что камера левого желудочка обнажена и начинает сочиться. Осторожно вдавите сердце обратно в грудную полость с помощью ватного тампона, зашивайте мышцы, ребра и кожу, используя восемь швов с нулевым проленом, и тщательно очистите мышь после операции. Перенесите мышь с рабочей платформы на нагревательное одеяло на 37 градусов, чтобы согреть тело сразу после операции.
Подтвердите антибиоз мыши, наблюдая за признаками спонтанного восстановления дыхания, изменением цвета кожи от бледного до розового и движением конечностей. Отведите прооперированную мышь обратно к ее матери, как только она выздоровеет. При необходимости смешайте управляемую мышь и материалы гнездования ее матери.
Соберите сердце усыпленной неонатальной мыши CX3-CR1-GFP через день после апикальной резекции и погрузите его в 10-сантиметровую посуду с PBS. Отрежьте сосуды и оставшуюся соединительную ткань от желудочков. Отрежьте ушной аппендикс и отток от сердца.
После того, как сердце перестанет биться, разрежьте сердце на один-два кубических миллиметра в фосфатном солевом буфере с помощью микрохирургических ножниц. Переложите их в трубку, содержащую 2,5 миллилитра предварительно нагретой ферментной смеси и плотно закройте трубку. Перевертите трубку и поместите ее колпачком вниз, а затем запустите программу диссоциации сердца новорожденных.
Отсоедрите трубку от диссоциатора после завершения программы. Добавьте в трубку 7,5 миллилитров 1x DMEM с 10% FBS. Отфильтруйте и перенесите суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Центрифугировать клеточную суспензию в 300 раз G в течение пяти минут. Повторно суспендировать клеточную гранулу в одном миллилите раствора лизиса клеток крови и инкубировать в течение двух минут при комнатной температуре. Добавьте от 5 до 10 миллилитров фосфатного солевого буфера в суспензию и центрифугу в 300 раз больше G в течение пяти минут.
Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре DMEM с 10% FBS, затем отсортируйте GFP-положительные неонатальные сердечные макрофаги по факсу. Отсортируйте макрофаги в стерильную трубку, содержащую 500 миллилитров DMEM с 10% FBS. Подсчитайте GFP-положительные макрофаги и повторно суспендируете их в DMEM с 10% FBS в концентрации миллиона макрофагов на 200 миллилитров DMEM для последующей инъекции.
Неонатальные сердечные макрофаги были введены в сердце миокарда взрослой мыши, и эффективность пролиферативных кардиомиоцитов была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием. Статистический анализ показывает, что пролиферация кардиомиоцитов увеличивается после трансплантации макрофагов. Изображения эхокардиограммы показывают сердечную функцию у взрослой мыши через месяц после инфаркта миокарда.
Сердечная функция усиливается после трансплантации макрофагов. Масса при окрашивании показывает, что инфарктная область у взрослой мыши через месяц после инфаркта миокарда была значительно уменьшена после трансплантации неонатального кардиофага. Трансплантация макрофагов сердца новорожденных может быть стратегией продвижения для содействия регенерации сердца во рту у взрослых.
Этот протокол помогает исследователям заниматься разработкой регенеративных приложений и исследовать механизм регенерации сердца.
