成体マウスへの新生児マウス心臓マクロファージ移植

このプロトコルは、新しい中心臓マクロファージの分離と成体マウスへの移植を示しており、これは心臓修復を促進する寛容な方法である可能性がある。この技術の意味は、心臓再生分野に拡張することができます。青銅の運転プラットフォームを摂氏20度で一晩事前冷却することから始めます。

麻酔をかけ、アイスボックスからマウスを取り出し、プラットフォーム上に置きます。医療用粘着テープを使用して、マウスをスピーヌ位置に固定します。マウスをステレオスコープの下に置き、ベタジンと70%アルコールを浸した準備パッドを使用してマウスの胸部を消毒します。

胸腔の4番目の肋間領域で1センチメートルの切り傷を皮膚に切り取り、心臓がアクセスされるまで微小なはさみを使用して肋間筋を分離する。心臓が機械的損傷を受けずに胸から外装されるまで、2つの鉗子の助けを借りて胸と腹部を交互に押します。小さな切開部の下と上の肋骨を心臓を固定化する自然な固定として設定し、左心室の頂点を見つけ、あなたの虹部はさみを使用して心室の頂点組織の1ミリメートルの直径を切断します。

左心室が露出し、にじみ出るを確認します。綿棒を使用して心臓を胸腔に静かに押し込み、8本ずつゼロのプロレン縫合糸を使用して筋肉、肋骨、皮膚を縫合し、手術後にマウスを十分にきれいにします。操作プラットフォームから37度の加熱毛布にマウスを移し、操作直後に体を温めます。

マウスの抗バイオビシスを確認するには、自発的呼吸回復の兆候、肌の色の変化が淡いからピンクに、手足の動き。それが回復したら、操作したマウスを母親に戻します。操作されたマウスと、必要に応じて母親のネスティング材料を混ぜ合わせた。

安楽死させた新生児CX3-CR1-GFPマウスの心臓を、頭頂部切除の翌日に収穫し、PBSで10センチメートル皿に浸します。血管と残りの結合組織を心室から切り離します。耳介の付録と流出管を心臓から切り取ります。

心臓が鼓動を止めた後、微小手術ハサミを使用してリン酸生理食塩液中の1〜2立方ミリメートルの部分に心臓を切断する。2.5ミリリットルの予熱酵素ミックスを含むチューブに移し、チューブをしっかりと閉じます。チューブを反転し、キャップを下に置き、新生児心臓解離プログラムを実行します。

プログラムの完了後に、分離器からチューブを取り外します。チューブに10%FBSの1x DMEMの7.5ミリリットルを加えます。15ミリリットルの遠心分離管に懸濁液をフィルターして移します。

細胞懸濁液を300倍Gで5分間遠心する。血液細胞溶解液の1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、室温で2分間インキュベートする。5~10ミリリットルのリン酸生理食塩水バッファーを懸濁液に加え、遠心分離機をGの300倍で5分間加える。

10%FBSでDMEMの1ミリリットルで細胞ペレットを再中断し、次にファックスでGFP陽性新生児心臓マクロファージを並べ替えます。マクロファージを10%FBSで500ミリリットルのDMEMを含む無菌チューブに分類します。GFP陽性マクロファージをカウントし、後で注射するためにDMEMの200ミリリットル当たり100万マクロファージの濃度で10%FBSでDMEMでそれらを再中断します。

新生児心臓マクロファージを心筋梗塞成体マウス心臓に注入し、増殖性心筋細胞の効率を免疫蛍光染色により確認した。統計解析は、マクロファージ移植後に心筋細胞増殖が増加することを示す。心エコー図画像は、心筋梗塞の1ヶ月後に成体マウスの心機能を示す。

マクロファージ移植後の心臓機能が増強される。染色における質量は、新生児心臓マクロファージ移植後、心筋梗塞の1ヶ月後に成体マウスの梗塞領域が著しく減少したことを示している。新生児心臓マクロファージ移植は、成人の口の心臓再生を促進するための促進戦略である可能性があります。

このプロトコルは、研究者が再生アプリケーション開発を追求し、心臓再生メカニズムを探求するのに役立ちます。