يوضح هذا البروتوكول انفصال الضامة القلبية الوسطى الجديدة وزرعها في الفئران البالغة ، والتي قد تكون طريقة متساهلة لتعزيز إصلاح القلب. ويمكن توسيع نطاق الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى مجال تجديد القلب. ابدأ قبل تبريد منصة التشغيل البرونزية بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية.
أخرج الفأر المخدر من صندوق الثلج وضعه على المنصة. مرساة الماوس في موقف supine باستخدام شريط لاصق الطبية. وضع منصة التشغيل مع الماوس تحت مجسمة، وتطهير الصدر الماوس باستخدام لوحة الإعدادية غارقة مع بيتادين والكحول 70٪.
قطع الجلد مع سنتيمتر واحد في المنطقة الوربية الرابعة من تجويف الصدر، وفصل العضلات الوربية باستخدام مقص الجراحة الدقيقة حتى يتم الوصول إلى القلب. اضغط بالتناوب على الصدر والبطن بمساعدة اثنين من ملقط حتى يتم إخراج القلب من الصدر دون أي ضرر ميكانيكي. تعيين الأضلاع تحت وفوق شق صغير كتأثير طبيعي لشل حركة القلب، وتحديد قمة البطين الأيسر وقطع قطر ملليمتر واحد من الأنسجة قمة البطين باستخدام مقص استئصال قزحية الخاص بك.
تأكد من تعرض الغرفة البطينية اليسرى وتبدأ في النضح. اضغط بلطف القلب مرة أخرى إلى تجويف الصدر باستخدام مسحة القطن، خياطة العضلات والأضلاع والجلد باستخدام ثمانية من قبل صفر الغرز البرولين وتنظيف الماوس جيدا بعد العملية. نقل الماوس من منصة التشغيل إلى بطانية التدفئة 37 درجة لتسخين الجسم مباشرة بعد العملية.
تأكيد antibiosis من الماوس من خلال مراقبة لعلامات استعادة التنفس العفوية، وتغيير لون البشرة من شاحب إلى وردي وحركة الأطراف. خذ الماوس الذي تم تشغيله مرة أخرى إلى الأم بمجرد أن يتعافى. الاختلاط الماوس تعمل وانها مواد التعشيش الأم، إذا لزم الأمر.
حصاد قلب فأرة حديثي الولادة القتل الرحيم CX3-CR1-GFP بعد يوم واحد من استئصال apical وتزج به في طبق 10 سم مع برنامج تلفزيوني. قطع الأوعية والأنسجة الضامة المتبقية بعيدا عن البطينين. قطع الزائدة الدودية المسالك من القلب.
بعد توقف القلب عن النبض قطع القلب إلى قطعة واحدة إلى اثنين ملليمتر مكعب في العازلة المالحة الفوسفات باستخدام مقص الجراحية الدقيقة. نقلها إلى أنبوب يحتوي على 2.5 ملليلتر من مزيج الانزيم مسخن وإغلاق بإحكام الأنبوب. عكس الأنبوب ووضعه مع الغطاء إلى أسفل، ثم تشغيل برنامج تفكك القلب حديثي الولادة.
فصل الأنبوب من المفكك بعد اكتمال البرنامج. أضف 7.5 ملليلتر من 1x DMEM مع 10٪ FBS إلى الأنبوب. تصفية ونقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من محلول تحلل خلايا الدم واحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. أضف 5 إلى 10 ملليلترات من العازلة المالحة للفوسفات إلى نظام التعليق والطرد المركزي بمعدل 300 مرة G لمدة خمس دقائق.
إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من DMEM مع 10٪ FBS، ثم فرز الضامة القلبية الوليدية إيجابية GFP عن طريق الفاكس. فرز الضامة في أنبوب معقم يحتوي على 500 ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. عد الضامة الإيجابية GFP وإعادة تعليقها في DMEM مع 10٪ FBS بتركيز مليون الضامة لكل 200 ملليلتر من DMEM للحقن في وقت لاحق.
تم حقن الضامة القلبية الوليدية في قلب فأر البالغين المتشحش عضلة القلب وتم تأكيد كفاءة خلايا القلب التكاثرية عن طريق تلطيخ المناعة. يظهر التحليل الإحصائي أن انتشار خلايا القلب يزداد بعد زرع الضامة. تظهر صور تخطيط صدى القلب وظيفة القلب في فأر بالغ بعد شهر واحد من احتشاء عضلة القلب.
يتم تعزيز وظيفة القلب بعد زرع الضامة. تظهر الكتلة في التلطيخ أن المنطقة المتشتة في فأر بالغ بعد شهر واحد من احتشاء عضلة القلب قد انخفضت بشكل ملحوظ بعد زرع الضامة القلبية الوليدية. قد تكون زراعة الضامة القلبية الوليدية استراتيجية ترويجية لتعزيز تجديد قلب الفم لدى البالغين.
يساعد هذا البروتوكول الباحثين على متابعة تطوير التطبيقات التجديدية واستكشاف آلية تجديد القلب.
