이 프로토콜의 전반적인 목표는 E2 효소 특이성, 기판 선택 및 유비퀴틴 전송을 포함한 E3 리개아제 기능의 중요한 주요 측면을 분석하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 진핵 소스의 단백질이 특수 장비없이 시험관에서 재조합적으로 표현되고 연구 될 수 있기 때문에 넓은 적용성입니다. 리신 방전 기법을 처음으로 사용하는 경우, 효소 농도와 같은 분석 파라미터를 최적화하여 E3 리게아제에 이상적인 배출 조건을 식별하는 것이 중요하다.
시험관 내 자동 유비쿼터션 분석기를 수행하기 위해, 다른 E2 효소의 기능성을 테스트하고 모든 유비쿼터티션 반응과 하나의 추가 반응에 대한 얼음에 마스터 믹스를 준비하는 파이펫팅 방식을 설정합니다. 다음으로, 적절한 튜브에 E2 효소 1개의 마이크로몰라를 추가하고, 표시된 조건하에서 2시간 동안 PCR 열 사이클러에 샘플을 배양한다. 인큐베이션 후 각 반응에 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 여러 번 파이펫팅하여 혼합합니다.
그런 다음 즉시 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓이고 변성 단백질을 섭씨 20도에서 보관합니다. 체외 기판 유비쿼터스 분석기를 수행하려면 모든 반응에 대한 파이펫팅 방식을 준비합니다. 하나의 반응에 필요한 마스터 믹스의 양을 계산한 후, 얼음에 대한 모든 반응에 대한 마스터 믹스를 준비하고 각 튜브에 마스터 믹스를 추가합니다.
각각의 E3 리개구를 개별적으로 추가합니다. 그런 다음 시연된 대로 PCR 열 사이클러에서 샘플을 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 반응에 두 번 SDS 샘플 버퍼를 추가하고, 파이펫팅으로 여러 번 혼합하고, 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.
리신 방전 분석기를 수행하려면 충전 반응에 대한 파이펫팅 방식을 설정하고 섭씨 37도에서 15 분 동안 충전 반응을 배양하십시오. 충전 반응을 중지하려면 밀리리터당 1.8단위의 최종 농도에 아피라제를 추가하고 실온에서 5분 동안 반응을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 EDTA를 최종 농도30 밀리머에 추가하고 이중 증류수를 사용하여 반응의 부피를 30 마이크로리터로 조정합니다.
E3에 의한 E2 유비쿼터티화를 배출하기 위해 실험시 시점에 해당하는 5개의 튜브를 설정하고, 각 튜브에 6.7 마이크로리터의 비환화를 추가하고, 시간점 제로 튜브에서 정지된 충전 반응의 6마이크로리터를 제거하고, 총 부피를 26.7 마이크로리터로 조정한다. 방전 반응을 설정하려면 각 반응에 이중 증류수, 유비쿼터틸션 버퍼, BSA, 리신, E3 리게아제 및 충전된 E2를 추가합니다. 선택한 기간 이후에, 각 방전 반응에서 20 마이크로리터 샘플을 해당 샘플 튜브로 이송한다.
그런 다음 즉시 샘플을 소용돌이쳐 10 분 동안 섭씨 70도에 놓습니다. 이 대표적인 서양 얼룩 분석에서 비활성 칩은 자동 보편화되지 않았습니다. 그러나, E3 독립적인 유비퀴틴 제품은 비활성 칩의 존재와 칩이 없는 상태에서 형성되었다.
야생형 칩은 UBE2D 및 UBE2E 제품군의 단백질과 결합될 때 자동 보편화되었으며, 무료 폴리비비퀴틴 체인은 UBE2D 제품군의 단백질과 협력하여 생산되었지만 UBE2E 제품군의 단백질과는 달리. UBE2N/V1의 유비퀴틴 의 결합은 무료 유비퀴틴 체인의 형성을 지휘했다. UNC-45B의 자동 유비쿼터션 및 유비쿼터션은 야생형 칩으로 관찰되었지만 칩의 비활성 돌연변이가 아닌, UNC-45B가 칩에 대한 보존기판역할을 한다는 것을 나타낸다.
칩의 촉매 활성이 리신 방전 분석서를 사용하여 분석되었을 때, 충전되지 않은 UBE2D2 효소는 17킬로달톤의 분자량을 가지고 있으며, 단일 유비퀴틴 분자를 가진 충전된 UBE2D2는 약 26킬로달톤의 분자량을 가졌다. 0시에 충전된 전체 E2 수율이 관찰되었습니다. 비활성 칩의 존재에서, UBE2D2의 희미한 E3 리게아독립적 방전하지만 칩의 자동 유비쿼터스검출되지 않았다.
와일드 타입 CHIP의 존재에서, UBE2D2의 방전은 60 분 이내에 빠르고 완료되었고, CHIP의 자동 유비쿼터션은 자신의 lysine 잔류물에 유비퀴틴의 전송을 나타냈다. 제한된 E2 능력으로 인해 가능한 한 빨리 작동하고 즉시 SDS-PAGE 및 서양 블로팅다음에 방전 반응을 진행합니다. 이러한 시험관 내 유비쿼터틸화 프로토콜에 이어, 특정 유비쿼터틸화 연계 유형은 연결성 항체를 가진 서양 얼룩을 조사하여 식별할 수 있다.
