גישה חוץ גופית לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה: מודל Cybrid

יצירת סייבר היא עדיין הפרוטוקול המשוכלל להבנת התפקיד הפתוגני של כל מוטציה חדשה בדנ"א המיטוכונדריאלי ולתאמות את אחוז האטריפלסמיה לחומרת המחלה. טכניקה זו מאפשרת ביצוע חקירה ביוכימית במערכת גרעינית הומוגנית, שבה נעדרת תרומת הרקע הגרעיני של המטופל. טכניקה זו מאפשרת לאמת את הפתוגניות של מוטציה של הדנ"א המיטוכונדריאלי.

ומאפשר לחקור את השפעתו ברמה הביוכימית לשטוף את הכלים 35 מילימטר המכילים את הפיברובלסטים פעמיים באמצעות שני מיליליטרים של 1X PBS ללא סידן ומגנזיום. מנקים את המשטח החיצוני של הכלים עם 70% אתנול, ומחכים עד שהאלכוהול יתאדה. מוציאים את המכסים מהכלים ואת פקקי הברגים מהבקבוקים.

מניחים כל מנה ללא המכסה הפוך בתחתית כל בקבוק צנטריפוגה של 250 מיליליטר. לאט לאט מוסיפים 32 מיליליטרים של מדיום נוקלאציה לכל בקבוק ומאפשרים למדיום להיכנס לצלחת ולבוא במגע עם התאים. מוציאים את כל הבועות מהכלים באמצעות פיפטת מרעה ארוכה מזכוכית, ומעוגלים את הקצה בלהבת בונזן.

סגור כל בקבוק עם פקק הבורג, והעביר אותם לצנטריפוגה. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 8, 000 x G.לשאוף את המדיום מן הבקבוקים ולהשליך אותו. מוציאים את הכלים על ידי היפוך הבקבוקים על גזה סטרילית שרוססה בעבר ב-70% אתנול.

נקו את המשטח החיצוני של הכלים והמכסים שלהם ב-70% אתנול, וסגרו את הכלים לאחר שהאתנול מתאדה. לפני שנמשיך לבדוק היווצרות ציטופלסט באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור תאים חיים. חפשו פיברובלסטים מוארכים במיוחד עקב שחול של הגרעינים שלהם המושרה על ידי ציטוכלאסין.

לכל מנה של 35 מילימטר מוסיפים 1, 000, 143 שורות אפס תאים. מושעה מחדש בשני מיליליטרים של מדיום תרבית בתוספת 5% FBS. השאירו את הכלים במשך שלוש שעות באינקובטור פחמן דו-חמצני לח כדי ליישב את 143 תאי האפס בשורה על רוחות הרפאים.

לאחר שלוש שעות של דגירה, לשאוף ולהשליך את המדיום. לשטוף את תאי הדבקות פעמיים עם שני מיליליטרים של מדיום גלוקוז גבוה DMEM ללא סרום או MEM, ואז לשאוף ולהשליך את המדיום. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת פוליאתילן גליקול לתאים ודגירו למשך דקה אחת בדיוק.

לשאוף ולהשליך את תמיסת הפוליאתילן גליקול. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של DMEM גלוקוז גבוה ללא סרום או עם MEM. מוסיפים שני מיליליטרים של מדיום היתוך, ומחממים לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

נסו את התאים במנות התרבית הנותרות ספרו אותם וזרעו אותם לצלחות פטרי אחת או יותר הוסיפו 50 עד 100 תאים למנה בתרבית התוסף עד להופעת שיבוטים. אז תן להם לגדול במשך כמה ימים. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, הרימו את השיבוטים מצלחת פטרי עם גלילי שיבוט או קצה פיפטה.

נסו להימנע מאגום שיבוטים שונים ולהעביר אותם לצלחת 96 באר, שכל באר מכילה 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבית משלים. Cybrids נוצרו החל מפיברובלסטים שמקורם בחולה שנשא את M2343A2G ההטרופלסמי אחת ממוטציות הדנ"א המיטוכונדריה הנפוצות ביותר הקשורות למיופתיה מיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה חומצה לקטית ואפיזודות דמויות שבץ. ניתוח של מספר משתנה של חזרות טנדם הראה כי דנ"א סייבר זהה לתאי האפס בשורה המאשרים את החלפת הדנ"א הקיברנטי של המטופל בגנום 143 B.

ניתן להשתמש בפולימורפיזם של אורך מקטע הגבלה, או בניתוחי ריצוף, כדי להעריך את נוכחותה של מוטציית הדנ"א המיטוכונדריאלי ואת אחוז ההטרופלזמה. כאשר מנסים פרוטוקול זה חשוב לאמת את הנכס הגנטי הנכון של הדנ"א הנוקליאון והמיטוכונדריאלי, כמו גם את כמות הדנ"א המיטוכונדריאלי בציברידים המאוכלסים מחדש.