טכניקה זו סיפקה תמונה שלמה ותלת-ממדית יותר של איברים שקופים שלמים והייתה שימושית לכימות, לא רק של שכפול, אלא גם של טפיל רדום ותאי גורם חיסוני. טכניקה זו מאפשרת לנו לקבוע את הקשר המיוחד של טפילים, תאי מערכת החיסון והנזק לרקמות הנובע מהזיהום. גם אפיטופ אימונוסטינינג ותיוג דנ"א היו דומים לטכניקה זו.
פרוטוקול זה שימש ביעילות להערכת תוצאות הטיפול במודלים עכבריים של מחלת צ'אגאס. טיפול במינונים אישיים גבוהים יותר, הניתן בתדירות נמוכה יותר לאורך תקופת טיפול ממושכת, מבטל הן את השכפול והן את הטפילים הרדומים. מי שידגים את ההליך יהיה קיילב הוקינס, טכנאי מחקר ממעבדתו של ריק טרלטון.
לאחר המתת חסד, ניתוח ותיקון איבריו של עכבר נגוע כמתואר בכתב היד, יש לטבול איברים בודדים ב-10 מיליליטר של 50% מדולל מים CUBIC-L, עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר למשך הלילה המוגנים מפני אור. למחרת, החלף 50% CUBIC-L עם 10 מיליליטר של 100% CUBIC-L, ודגירה במשך שישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, תוך שמירה על צינור שטוח על אינקובטור שייקר. בסוף תקופת הדגירה הזו, הרקמות צריכות להיות שקופות כמעט לחלוטין.
לשטוף את האיברים השקופים פעמיים עם PBS במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס, עם רעידות עדינות. עם כל שטיפה, להעביר את הרקמות לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר כדי להסיר Triton X-100. עבור צביעת DNA, דלל את צבע חומצת הגרעין הזמין מסחרית בחמישה מיליליטר של חיץ מכתים בשעה 1:2, 500.
לאחר מכן, לטבול את הרקמה בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל תמיסת צבע גרעינית, ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס, עם סיבוב עדין במשך חמישה ימים במצב עומד. שטפו את הרקמה שלוש פעמים עם 15 מיליליטר של חיץ כביסה מכתים גרעיני תלת-ממדי במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, עם ניעור עדין. חישוב הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים ומשניים.
מערבבים נוגדנים ראשוניים ומשניים בצינור ענבר של שני מיליליטר, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. להחלפת חיץ, יש לערבב 7.5 מיליליטר של חיץ חיסוני תלת-ממדי HV1 כפול עם 7.5 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים. לטבול את דגימת הרקמה במאגר, ולדגור במשך 1.5 שעות ב 32 מעלות צלזיוס, עם רעידות עדינות בצינור חרוטי 15 מיליליטר במצב אופקי.
אסוף את דגימת הרקמה ממצע חילופי החיץ, וטבל אותה בתמיסת צביעת הנוגדנים. לדגור רקמות בנפרד במשך שבוע אחד בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס, לנער בעדינות את הצינורות במצב עמידה הרחק מהאור. מעבירים את דגימות הרקמה לארבע מעלות צלזיוס, ודוגרים במצב עמידה.
לאחר קירור חיץ הכביסה התלת-ממדי HV1 לארבע מעלות צלזיוס, יש לשטוף את הדגימה ב-15 מיליליטר של חיץ פעמיים בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כל אחת עם ניעור עדין במצב אופקי. יש לדלל את הפורמלין ל-1% במאגר הכביסה התלת-ממדי HV1, ולטבול את הדגימה בשמונה מיליליטר של התמיסה למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס, עם טלטול עדין. כעת, דגרו את הדגימה בתמיסת 1% פורמלין טרייה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ושטפו ב-15 מיליליטר PBS במשך שעתיים ב-25 מעלות צלזיוס.
לטבול איברים שקופים בצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של 50% תמיסת CUBIC-R+מדוללת במים בטמפרטורת החדר, עם ניעור עדין. החליפו אותו בחמישה מיליליטר 100% CUBIC-R+ודגרו עם ניעור עדין במשך יומיים. יבש את הרקמות באמצעות Kimwipes, ולאחר מכן, להעביר אותם חמישה מיליליטר של תמיסה הרכבה בצלחת תרבית שש בארות, לדגור אותם בטמפרטורת החדר.
הדביקו את הרקמות למחזיק דגימת המיקרוסקופ באמצעות דבק-על ג'ל. לטבול את הדגימות במיקרוסקופ קוורץ cuvette מלא 120 מיליליטר של תמיסת הרכבה. דמיינו אותם באופן רוחבי לציר האורך שלהם, ודבקו את הלב, כאשר ה-apex ואבי העורקים מיושרים אופקית.
לב משוחזר בתלת-ממד של טריפנוסומה קרוזי הציג שיעור גבוה יותר של תאים נגועים באטריום, בהשוואה לחדרים. ניתן לזהות טפילים רדומים בלב, כפי שמתואר בסטים המוגדלים בתלת מימד. תאי T המבטאים ZsGreen1, כמו גם תאים נגועים בטריפנוסומה קרוזי, הודגמו בשרירי השלד מעכבר כתב CD8 הנגוע בטריפנוסומה קרוזי.
זום-אין תלת-ממדי של תמונה משוחזרת בתלת-ממד זיהה תאי T באזור של תא נגוע. הממשק של תאי T בתאים נגועים במארח הודגם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. בלבו של עכבר חסר חיסון זוהו תאים מארחים שנדבקו בשני זנים שונים של טריפנוזומה קרוזי, וחיתוך דרך הרקמות הראה שפע של תאים נגועים בטפילים באטריה של הלב בעומקי רקמות שונים.
זיהוי חיסוני של כלי דם בטריפנוסומה קרוזי נגוע לב מנוקה חושף את כלי הדם המורכבים של הלב. תאים נגועים בטפיל ניתן לראות באטריה של הלב. צביעה גרעינית של שרירי השלד הראתה הצטברות של גרעינים באזורים עם מעט או טפילי tdTomato שאינם ניתנים לזיהוי.
חיזוק סמני הטפיל tdTomato ו-GFP עם נוגדנים נגד RFP, ו-GFP, ושרירי שלד שלמים מנוקים גרמו לפלואורסצנטיות חזקה. אז הנקודות הקריטיות הן זמן הדגירה במאגר המעוקב, זמן הדילול והדגירה בצבע הדנ"א, זמן הדגירה בנוגדנים וזמן הדגירה בתמיסת התאמת האינדקס השבירה. השימוש בכתמים נוספים, עם צביעת נוגדנים ספציפיים ותגובה מהירה, עשוי להגדיל באופן משמעותי את הפוטנציאל של טכניקה זו, ולאפשר זיהוי של תאים, תהליכים ומבנה מרובים באיברים שלמים.
כעת יש לנו דרך טובה ושלמה יותר לחקור את תאי מערכת החיסון האחראים להריגת הטפילים, את הרקמות שבהן הטפילים ממשיכים להתקיים באופן כרוני, ואת התפלגות התרופות הספציפיות לרקמות.
