Diese Technik lieferte ein vollständigeres und 3D-Bild ganzer transparenter Organe und war nützlich für die Quantifizierung, nicht nur von replizierenden, sondern auch von ruhenden Parasiten- und Immunfaktorzellen. Diese Technik ermöglicht es uns, die spezielle Assoziation von Parasiten, Immunzellen und den durch die Infektion resultierenden Gewebeschäden zu bestimmen. Epitop-Immunfärbung und DNA-Markierung waren ebenfalls vergleichbar mit dieser Technik.
Dieses Protokoll wurde effektiv zur Bewertung der Behandlungsergebnisse in Mausmodellen der Chagas-Krankheit verwendet. Eine Behandlung mit höheren Einzeldosen, die seltener über einen längeren Behandlungszeitraum verabreicht werden, eliminiert sowohl replizierende als auch ruhende Parasiten. Caleb Hawkins, ein Forschungstechniker aus Rick Tarletons Labor, demonstriert das Verfahren.
Nach dem Einschläfern, Sezieren und Fixieren der Organe einer infizierten Maus, wie im Manuskript beschrieben, tauchen Sie einzelne Organe in 10 Milliliter 50% wasserverdünntem CUBIC-L ein, wobei Sie sie bei Raumtemperatur in 50-Milliliter-konischen Röhrchen leicht vor Licht geschützt schütteln. Ersetzen Sie am nächsten Tag 50% CUBIC-L durch 10 Milliliter 100% CUBIC-L und inkubieren Sie sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius, während Sie das Röhrchen flach auf dem Shaker-Inkubator halten. Am Ende dieser Inkubationszeit sollten die Gewebe fast vollständig transparent sein.
Waschen Sie die durchsichtigen Organe zweimal mit PBS für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Bei jeder Wäsche werden die Gewebe in ein neues 50-Milliliter-konisches Röhrchen überführt, um Triton X-100 zu entfernen. Für die DNA-Färbung verdünnen Sie den handelsüblichen Nukleinsäurefarbstoff in fünf Milliliter Färbepuffer bei 1: 2, 500.
Dann tauchen Sie das Gewebe in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen mit Kernfarbstofflösung und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit sanfter Rotation für fünf Tage in stehender Position. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit 15 Milliliter 3D-Kernfärbungspuffer für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Berechnen Sie die erforderliche Menge an primären und sekundären Antikörpern.
Mischen Sie primäre und sekundäre Antikörper in einem bernsteinfarbenen Zwei-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden. Für den Pufferaustausch mischen Sie 7,5 Milliliter 2x HV1 3D-Immunfärbungspuffer mit 7,5 Milliliter doppelt destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Gewebeprobe in den Puffer und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang bei 32 Grad Celsius unter leichtem Schütteln in einem 15-Milliliter-konischen Röhrchen in horizontaler Position.
Sammeln Sie die Gewebeprobe aus dem Pufferaustauschmedium und tauchen Sie sie in die Antikörperfärbelösung. Inkubieren Sie das Gewebe eine Woche lang einzeln bei 32 Grad Celsius und schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig im Stehen, weg vom Licht. Die Gewebeproben auf vier Grad Celsius bewegen und im Stehen inkubieren.
Nach dem Abkühlen des HV1 3D-Immunfärbungs-Waschpuffers auf vier Grad Celsius waschen Sie die Probe mit 15 Milliliter Puffer zweimal bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, jeweils mit leichtem Schütteln in horizontaler Position. Verdünnen Sie Formalin auf 1% in HV1 3D-Immunfärbungs-Waschpuffer und tauchen Sie die Probe 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln in acht Milliliter der Lösung. Nun inkubieren Sie die Probe in frischer 1% Formalinlösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und waschen Sie 15 Milliliter PBS für zwei Stunden bei 25 Grad Celsius.
Tauchen Sie transparente Organe unter leichtem Schütteln in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen mit fünf Milliliter 50%iger wasserverdünnter CUBIC-R+-Lösung. Ersetzen Sie es durch fünf Milliliter 100% CUBIC-R+ und inkubieren Sie es mit leichtem Schütteln für zwei Tage. Trocknen Sie die Gewebe mit Kimwipes und überführen Sie sie dann in fünf Milliliter Montagelösung in einer Sechs-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.
Kleben Sie die Gewebe mit Gel-Sekundenkleber auf den Probenhalter des Mikroskops. Tauchen Sie die Proben in die mit 120 Milliliter Montagelösung gefüllte Quarzküvette des Mikroskops. Stellen Sie sie quer zu ihrer Längsachse vor und haften am Herzen, wobei die Spitze und die Aorta horizontal ausgerichtet sind.
3D-rekonstruiertes Trypanosoma cruzi-infiziertes Herz zeigte einen höheren Anteil infizierter Zellen im Vorhof im Vergleich zu Ventrikeln. Ruhende Parasiten können im Herzen identifiziert werden, wie in den 3D-vergrößerten Einsätzen dargestellt. ZsGreen1-exprimierende T-Zellen sowie Trypanosoma-cruzi-infizierte Zellen wurden im Skelettmuskel von einer CD8-Reportermaus visualisiert, die mit Trypanosoma cruzi infiziert war.
3D-Zoom-Ins von 3D-rekonstruierten Bildern identifizierten T-Zellen im Bereich einer infizierten Zelle. Die Grenzfläche von T-Zellen in wirtsinfizierten Zellen wurde durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Im Herzen einer immundefizienten Maus wurden Wirtszellen nachgewiesen, die mit zwei verschiedenen Stämmen von Trypanosoma cruzi infiziert waren, und das Durchschneiden der Gewebe zeigte reichlich parasiteninfizierte Zellen in den Herzatrien in verschiedenen Gewebetiefen.
Die Immundetektion des Gefäßsystems bei Trypanosoma cruzi-infiziertem und geklärtem Herzen zeigt das komplizierte Gefäßsystem des Herzens. Parasiteninfizierte Zellen konnten in den Herzvorhöfen beobachtet werden. Die Kernfärbung der Skelettmuskulatur zeigte eine Ansammlung von Kernen in Bereichen mit wenigen oder nicht nachweisbaren tdTomato-Parasiten.
Die Verstärkung von tdTomato- und GFP-Parasitenreportermarkern mit Antikörpern gegen RFP und GFP sowie der gesamten geklärten Skelettmuskulatur führte zu einer starken Fluoreszenz. Die kritischen Punkte sind also die Inkubationszeit im CUBIC-Puffer, die Verdünnungs- und Inkubationszeit im DNA-Farbstoff, die Inkubationszeit in den Antikörpern und die Inkubationszeit in der gebrochenen Index-Matching-Lösung. Die Verwendung zusätzlicher Färbung mit spezifischem Antikörperfarbstoff und schneller Reaktion könnte das Potenzial dieser Technik erheblich erhöhen und den Nachweis mehrerer Zellen, Prozesse und Strukturen in intakten Organen ermöglichen.
Wir haben jetzt einen besseren und vollständigeren Weg, um die Immunzellen zu erforschen, die für die Abtötung der Parasiten verantwortlich sind, die Gewebe, in denen die Parasiten chronisch persistieren, und die Verteilung der spezifischen Medikamente in die Gewebe.
