Cette technique a fourni une image 3D plus complète de l’ensemble des organes transparents et a été utile pour la quantification, non seulement de la réplication, mais aussi des cellules parasites dormantes et du facteur immunitaire. Cette technique nous permet de déterminer l’association particulière des parasites, des cellules immunitaires et des lésions tissulaires résultant de l’infection. L’immunomarquage des épitopes et le marquage de l’ADN étaient également comparables à cette technique.
Ce protocole a été utilisé efficacement pour évaluer les résultats du traitement dans des modèles murins de la maladie de Chagas. Un traitement à doses individuelles plus élevées, administrées moins fréquemment sur une période de traitement prolongée, élimine à la fois les parasites réplicatifs et dormants. Caleb Hawkins, un technicien de recherche du laboratoire de Rick Tarleton, fera la démonstration de la procédure.
Après euthanasie, dissection et fixation des organes d’une souris infectée comme décrit dans le manuscrit, plongez les organes individuels dans 10 millilitres de CUBIC-L dilué à 50%, en agitant doucement à température ambiante dans des tubes coniques de 50 millilitres pendant la nuit à l’abri de la lumière. Le lendemain, remplacez 50% CUBIC-L par 10 millilitres de 100% CUBIC-L et incuber pendant six jours à 37 degrés Celsius, tout en gardant le tube à plat sur l’incubateur vibreur. À la fin de cette période d’incubation, les tissus devraient être presque complètement transparents.
Lavez les organes transparents deux fois avec du PBS pendant deux heures à 37 degrés Celsius, en secouant doucement. À chaque lavage, transférez les tissus dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour retirer le Triton X-100. Pour la coloration de l’ADN, diluer le colorant d’acide nucléique disponible dans le commerce dans cinq millilitres de tampon de coloration à 1:2, 500.
Ensuite, immergez le tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant une solution de colorant nucléaire et incuber à 37 degrés Celsius, avec une rotation douce pendant cinq jours en position debout. Lavez le mouchoir trois fois avec 15 millilitres de tampon de lavage anticoloration nucléaire 3D pendant deux heures à température ambiante, en secouant doucement. Calculez la quantité requise d’anticorps primaires et secondaires.
Mélanger les anticorps primaires et secondaires dans un tube ambré de deux millilitres et incuber à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Pour l’échange de tampon, mélanger 7,5 millilitres de tampon d’immunomarquage 3D HV1 avec 7,5 millilitres d’eau bidistillée. Immerger l’échantillon de tissu dans le tampon et incuber pendant 1,5 heure à 32 degrés Celsius, en agitant doucement dans un tube conique de 15 millilitres en position horizontale.
Prélever l’échantillon de tissu dans le milieu d’échange tampon et l’immerger dans la solution de coloration des anticorps. Incuber les tissus individuellement pendant une semaine à 32 degrés Celsius, en secouant doucement les tubes en position debout loin de la lumière. Déplacez les échantillons de tissus à quatre degrés Celsius et incuber en position debout.
Après avoir refroidi le tampon d’immunomarquage 3D HV1 à quatre degrés Celsius, laver l’échantillon avec 15 millilitres de tampon deux fois à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, chacun en secouant doucement en position horizontale. Diluer le formol à 1% dans le tampon de lavage immunostatique HV1 3D et immerger l’échantillon dans huit millilitres de la solution pendant 24 heures à quatre degrés Celsius, en agitant doucement. Maintenant, incuber l’échantillon dans une solution fraîche de formol à 1% pendant une heure à 37 degrés Celsius et laver dans 15 millilitres de PBS pendant deux heures à 25 degrés Celsius.
Immerger les organes transparents dans un tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de solution CUBIC-R+ diluée à 50% d’eau à température ambiante, en agitant doucement. Remplacez-le par cinq millilitres 100% CUBIC-R+ et incuber en secouant doucement pendant deux jours. Sécher les tissus à l’aide de Kimwipes, puis transférez-les dans cinq millilitres de solution de montage dans une plaque de culture à six puits et incuberez-les à température ambiante.
Collez les tissus au porte-échantillon du microscope à l’aide de gel super glue. Plongez les échantillons dans la cuvette de quartz au microscope remplie de 120 millilitres de solution de montage. Imagez-les transversalement à leur axe longitudinal et adhérez au cœur, avec l’apex et l’aorte alignés horizontalement.
Le cœur infecté par Trypanosoma cruzi reconstruit en 3D présentait une proportion plus élevée de cellules infectées dans l’oreillette que les ventricules. Les parasites dormants peuvent être identifiés dans le cœur, comme illustré dans les encarts agrandis en 3D. Des lymphocytes T exprimant ZsGreen1, ainsi que des cellules infectées par Trypanosoma cruzi, ont été visualisés dans le muscle squelettique d’une souris rapporteur CD8 infectée par Trypanosoma cruzi.
Les zooms 3D d’une image reconstruite en 3D ont permis d’identifier des lymphocytes T dans la région d’une cellule infectée. L’interface des lymphocytes T dans les cellules infectées par l’hôte a été visualisée par microscopie confocale. Au cœur d’une souris immunodéficiente, des cellules hôtes infectées par deux souches différentes de Trypanosoma cruzi ont été détectées, et le découpage à travers les tissus a montré des cellules infectées par des parasites abondants dans les oreillettes cardiaques à différentes profondeurs tissulaires.
L’immunodétection du système vasculaire dans le cœur infecté et dégagé par Trypanosoma cruzi révèle le système vasculaire complexe du cœur. Des cellules infectées par des parasites ont pu être observées dans les oreillettes cardiaques. La coloration nucléaire du muscle squelettique a montré une accumulation de noyaux dans les zones où il y avait peu ou des parasites tdTomato indétectables.
La stimulation des marqueurs de la tomate et de la GFP avec des anticorps contre la RFP et la GFP, et l’ensemble du muscle squelettique dégagé a entraîné une forte fluorescence. Les points critiques sont donc le temps d’incubation dans le tampon CUBIC, le temps de dilution et d’incubation dans le colorant ADN, le temps d’incubation dans les anticorps et le temps d’incubation dans la solution d’appariement d’indice réfracté. L’utilisation de colorations supplémentaires, avec un colorant d’anticorps spécifiques et une réaction rapide, pourrait augmenter considérablement le potentiel de cette technique, permettant la détection de plusieurs cellules, processus et structures dans des organes intacts.
Nous avons maintenant une façon meilleure et plus complète d’explorer les cellules immunitaires responsables de tuer les parasites, les tissus où les parasites persistent de manière chronique et la distribution des médicaments spécifiques dans les tissus.
