이 기술은 전체 투명 장기에 대한보다 완전한 3D 이미지를 제공했으며 복제뿐만 아니라 휴면 기생충 및 면역 인자 세포의 정량화에도 유용했습니다. 이 기술을 통해 기생충, 면역 세포 및 감염으로 인한 조직 손상의 특별한 연관성을 확인할 수 있습니다. 에피토프 면역염색 및 DNA 표지도 이 기술과 유사하였다.
이 프로토콜은 샤가스병의 마우스 모델에서 치료 결과를 평가하는 데 효과적으로 사용되었습니다. 연장 된 치료 기간 동안 덜 자주 투여되는 더 높은 개별 용량의 치료는 복제 및 휴면 기생충을 모두 제거합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Rick Tarleton 연구실의 연구 기술자 인 Caleb Hawkins가 될 것입니다.
원고에 설명 된대로 감염된 마우스의 장기를 안락사, 해부 및 고정 한 후 각 장기를 50 % 물로 희석 한 CUBIC-L 10ml에 담그고 빛으로부터 보호 된 50 밀리리터 원추형 튜브에서 밤새 실온에서 부드럽게 흔들어줍니다. 다음날 50 % CUBIC-L을 100 % CUBIC-L 100ml로 교체하고 셰이커 인큐베이터에서 튜브를 평평하게 유지하면서 섭씨 37도에서 6 일 동안 배양합니다. 이 잠복기가 끝나면 조직은 거의 완전히 투명해야합니다.
투명한 장기를 PBS로 섭씨 37도에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 두 번 씻습니다. 세척 할 때마다 조직을 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨 Triton X-100을 제거합니다. DNA 염색을 위해, 시판되는 핵산 염료를 5밀리리터의 염색 완충액에 1:2, 500으로 희석한다.
그런 다음 핵 염료 용액이 들어있는 15 밀리리터 원추형 튜브에 조직을 담그고 섭씨 37도에서 서있는 자세로 5 일 동안 부드럽게 회전하면서 배양합니다. 15 밀리리터의 3D 핵 염색 세척 완충액으로 부드럽게 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 조직을 3 회 세척하십시오. 1 차 및 2 차 항체의 필요한 양을 계산하십시오.
호박색 2 밀리리터 튜브에 1 차 및 2 차 항체를 혼합하고 섭씨 37도에서 1.5 시간 동안 배양합니다. 완충액 교환을 위해 7.5 밀리리터의 2x HV1 3D 면역 염색 버퍼를 7.5 밀리리터의 이중 증류수와 혼합하십시오. 조직 샘플을 완충액에 담그고 섭씨 32도에서 1.5 시간 동안 배양하고 수평 위치의 15 밀리리터 원추형 튜브에서 부드럽게 흔든다.
완충액 교환 배지로부터 조직 샘플을 수집하고, 이를 항체 염색 용액에 침지시킨다. 섭씨 32도에서 일주일 동안 개별적으로 조직을 배양하여 빛에서 멀리 떨어진 서있는 위치에서 튜브를 부드럽게 흔 듭니다. 조직 샘플을 섭씨 4도로 옮기고 서 있는 자세에서 배양합니다.
HV1 3D 면역염색 세척 완충액을 섭씨 4도로 냉각한 후, 샘플을 15밀리리터의 완충액으로 섭씨 4도에서 30분 동안 두 번 세척하고, 각각 수평 위치에서 부드럽게 흔들었다. 포르말린을 HV1 3D 면역 염색 세척 완충액에서 1%로 희석하고 부드럽게 흔들면서 섭씨 4도에서 24시간 동안 용액 8밀리리터에 샘플을 담그십시오. 이제 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 신선한 1%포르말린 용액에 배양하고 섭씨 25도에서 2시간 동안 PBS 15밀리리터로 세척합니다.
투명한 장기를 실온에서 50 % 물 희석 CUBIC-R + 용액 50 밀리리터가 들어있는 50 밀리리터 원추형 튜브에 부드럽게 흔들어 담그십시오. 5 밀리리터 100 % CUBIC-R +로 교체하고 이틀 동안 부드럽게 흔들어 배양하십시오. Kimwipes를 사용하여 조직을 건조시킨 다음 6웰 배양 플레이트에 5밀리리터의 장착 용액으로 옮기고 실온에서 배양합니다.
젤 슈퍼 접착제를 사용하여 조직을 현미경 샘플 홀더에 부착합니다. 120ml의 장착 용액으로 채워진 현미경 석영 큐벳에 샘플을 담그십시오. 그것들을 세로축에 가로로 이미지화하고 정점과 대동맥이 수평으로 정렬된 상태에서 심장을 부착합니다.
3D 재구성 트리파노소마 크루지에 감염된 심장은 심실에 비해 심방에서 감염된 세포의 비율이 더 높았습니다. 휴면 기생충은 3D 확대 삽입에 묘사 된 것처럼 심장에서 식별 할 수 있습니다. ZsGreen1-발현 T 세포 뿐만 아니라 트리파노소마 크루지-감염된 세포는 트리파노소마 크루지에 감염된 CD8 리포터 마우스로부터 골격근에서 시각화하였다.
3D 재구성 이미지의 3D 확대는 감염된 세포 영역에서 T 세포를 식별했습니다. 숙주-감염된 세포에서 T 세포의 계면을 공초점 현미경에 의해 시각화하였다. 면역 결핍 마우스의 심장에서 Trypanosoma cruzi의 두 가지 다른 균주에 감염된 숙주 세포가 검출되었으며, 조직을 통한 절단은 다양한 조직 깊이의 심장 심방에 풍부한 기생충 감염 세포를 보여주었습니다.
Trypanosoma cruzi에 감염되고 맑아진 심장에서 혈관구조의 면역 검출은 심장의 복잡한 혈관을 나타냅니다. 기생충에 감염된 세포가 심장 심방에서 관찰 될 수 있습니다. 골격근의 핵 염색은 td토마토 기생충이 거의 없거나 검출되지 않는 부위에 핵이 축적된 것으로 나타났습니다.
RFP 및 GFP에 대한 항체로 tdTomato 및 GFP 기생충 리포터 마커를 높이고 전체 골격근을 제거하면 강한 형광이 나타납니다. 따라서 임계점은 CUBIC 완충액에서의 배양 시간, DNA 염료의 희석 및 배양 시간, 항체에서의 배양 시간, 굴절 된 지수 일치 용액에서의 배양 시간입니다. 특정 항체 염료 및 빠른 반응과 함께 추가 염색을 사용하면 이 기술의 잠재력을 크게 증가시켜 손상되지 않은 장기에서 여러 세포, 공정 및 구조를 검출할 수 있습니다.
우리는 이제 기생충을 죽이는 면역 세포, 기생충이 만성적으로 지속되는 조직 및 조직으로의 특정 약물의 분포를 탐구하는 더 좋고 완전한 방법을 가지고 있습니다.
