この技術は、透明な臓器全体のより完全な3D画像を提供し、複製だけでなく、休眠中の寄生虫細胞や免疫因子細胞の定量化にも役立ちました。この技術により、寄生虫、免疫細胞、および感染に起因する組織損傷の特別な関連を決定することができます。エピトープ免疫染色およびDNA標識もこの技術に匹敵した。
このプロトコルは、シャーガス病のマウスモデルにおける治療転帰を評価するために効果的に使用されました。より高い個別用量の治療は、長期間の治療期間にわたってより少ない頻度で与えられ、複製および休眠中の寄生虫の両方を排除します。.手順を実演するのは、リック・タールトンの研究室の研究技術者であるカレブ・ホーキンスです。
原稿に記載されているように感染したマウスの臓器を安楽死させ、解剖し、固定した後、個々の臓器を10ミリリットルの50%水で希釈したCUBIC-Lに浸し、光から保護された50ミリリットルの円錐管に室温で穏やかに振とうします。翌日、50%CUBIC-Lを10ミリリットルの100%CUBIC-Lに交換し、シェーカーインキュベーター上でチューブを平らに保ちながら、摂氏37度で6日間インキュベートします。この潜伏期間の終わりには、組織はほぼ完全に透明になるはずです。
透明な臓器をPBSで2回、摂氏37度で2時間、穏やかに振とうします。洗浄するたびに、組織を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移してTriton X-100を取り外します。DNA染色の場合は、市販の核酸色素を5ミリリットルの染色バッファーで1:2, 500に希釈します。
次に、核色素溶液を含む15ミリリットルの円錐管に組織を浸し、摂氏37度で、静置姿勢で5日間穏やかに回転させてインキュベートします。組織を15ミリリットルの3D核染色洗浄バッファーで室温で2時間、穏やかに振とうしながら3回洗浄します。一次抗体と二次抗体の必要量を計算します。
一次抗体と二次抗体を琥珀色の2ミリリットルのチューブで混合し、摂氏37度で1.5時間インキュベートします。バッファー交換には、7.5ミリリットルの2x HV1 3D免疫染色バッファーを7.5ミリリットルの二重蒸留水と混合します。組織サンプルをバッファーに浸し、15ミリリットルの円錐管で水平位置に穏やかに振とうしながら、摂氏32度で1.5時間インキュベートします。
バッファー交換培地から組織サンプルを採取し、抗体染色液に浸します。32°Cで1週間組織を個別にインキュベートし、光から離れた立った姿勢でチューブを静かに振ってください。組織サンプルを摂氏4度に移動し、立位でインキュベートします。
HV1 3D免疫染色洗浄バッファーを摂氏4度に冷却した後、15ミリリットルのバッファーでサンプルを摂氏4度で30分間2回、それぞれ水平に穏やかに振とうしながら洗浄します。ホルマリンをHV1 3D免疫染色洗浄バッファーで1%に希釈し、穏やかに振とうしながら、サンプルを摂氏4度で24時間8ミリリットルの溶液に浸します。次に、サンプルを新鮮な1%ホルマリン溶液で摂氏37度で1時間インキュベートし、15ミリリットルのPBSで摂氏25度で2時間洗浄します。
透明な臓器を、50ミリリットルの50%水で希釈したCUBIC-R +溶液を含む50ミリリットルの円錐管に室温で軽く振とうしながら浸します。5ミリリットルの100%CUBIC-R +と交換し、2日間穏やかに振とうしながらインキュベートします。キムワイプを使用して組織を乾燥させた後、6ウェル培養プレート内の5ミリリットルのマウント溶液に移し、室温でインキュベートします。
ゲルスーパーグルーを使用して、組織を顕微鏡サンプルホルダーに接着します。120ミリリットルの封入液で満たされた顕微鏡石英キュベットにサンプルを浸します。それらを縦軸に対して横方向に画像化し、頂点と大動脈を水平に揃えて心臓を接着します。
3D再構成されたトリパノソーマクルジ感染心臓は、心室と比較して、心房内の感染細胞の割合が高いことを示した。休眠中の寄生虫は、3D拡大インセットに示されているように、心臓で識別できます。ZsGreen1発現T細胞、ならびにトリパノソーマ・クルジ感染細胞を、トリパノソーマ・クルジに感染したCD8レポーターマウス由来の骨格筋において可視化した。
3D再構成画像の3Dズームインにより、感染細胞の領域にあるT細胞が特定されました。宿主感染細胞におけるT細胞の界面を共焦点顕微鏡で可視化した。免疫不全マウスの心臓では、2つの異なる株のトリパノソーマクルジに感染した宿主細胞が検出され、組織をスライスすると、さまざまな組織の深さの心房に豊富な寄生虫感染細胞が見られました。
トリパノソーマクルジに感染し、クリアされた心臓における血管系の免疫検出は、心臓の複雑な血管系を明らかにします。心臓心房に寄生虫感染細胞が認められた。骨格筋の核染色は、tdTomato寄生虫がほとんどまたは検出できない領域に核の蓄積を示しました。
tdTomatoおよびGFP寄生虫レポーターマーカーをRFPおよびGFPに対する抗体でブーストし、骨格筋全体を透明にすると、強い蛍光が得られました。したがって、重要なポイントは、CUBICバッファーでのインキュベーション時間、DNA色素での希釈時間とインキュベーション時間、抗体でのインキュベーション時間、および屈折インデックスマッチング溶液でのインキュベーション時間です。特異的抗体色素と迅速な反応による追加の染色を使用すると、この技術の可能性が大幅に高まり、無傷の臓器の複数の細胞、プロセス、および構造の検出が可能になります。
私たちは今、寄生虫を殺す原因となる免疫細胞、寄生虫が慢性的に存続する組織、および組織への特定の薬物の分布を探索するためのより良い、より完全な方法を持っています。
