Esta técnica proporcionou uma imagem mais completa e 3D de órgãos transparentes inteiros e foi útil para a quantificação, não apenas de replicar, mas também de células de parasitas e fatores imunes adormecidos. Esta técnica nos permite determinar a associação especial de parasitas, células imunes e os danos teciduais resultantes da infecção. A imunossuagem de epitope e a rotulagem de DNA também foram comparáveis com essa técnica.
Este protocolo foi efetivamente utilizado para avaliar os desfechos de tratamento em modelos de camundongos da doença de Chagas. Um tratamento de doses individuais mais elevadas, dado com menos frequência durante um longo período de tratamento, elimina tanto parasitas replicados quanto dormentes. Demonstrando o procedimento estará Caleb Hawkins, um técnico de pesquisa do laboratório de Rick Tarleton.
Depois de eutanizar, dissecar e fixar os órgãos de um rato infectado como descrito no manuscrito, mergulhe órgãos individuais em 10 mililitros de 50% diluídos de água CUBIC-L, com suave agitação à temperatura ambiente em tubos cônicos de 50 mililitros durante a noite protegidos da luz. No dia seguinte, substitua 50% CUBIC-L por 10 mililitros de 100% CUBIC-L, e incuba por seis dias a 37 graus Celsius, mantendo o tubo plano na incubadora de shaker. Ao final deste período de incubação, os tecidos devem ser quase completamente transparentes.
Lave os órgãos transparentes duas vezes com PBS por duas horas a 37 graus Celsius, com agitação suave. A cada lavagem, transfira os tecidos para um novo tubo cônico de 50 mililitros para remover Triton X-100. Para coloração de DNA, diluir o corante de ácido nucleico comercialmente disponível em cinco mililitros de tampão de coloração em 1:2.500.
Em seguida, mergulhe o tecido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo solução de corante nuclear, e incubar a 37 graus Celsius, com rotação suave por cinco dias em posição de pé. Lave o tecido três vezes com 15 mililitros de tampão de lavagem de manchas nucleares 3D por duas horas em temperatura ambiente, com agitação suave. Calcule a quantidade necessária de anticorpos primários e secundários.
Misture anticorpos primários e secundários em um tubo âmbar de dois mililitros, e incubar a 37 graus Celsius por 1,5 horas. Para troca de buffer, misture 7,5 mililitros de tampão de imunostaining 3D 2x HV1 com 7,5 mililitros de água dupla destilada. Mergulhe a amostra de tecido no tampão e incubar por 1,5 horas a 32 graus Celsius, com agitação suave em um tubo cônico de 15 mililitros em uma posição horizontal.
Colete a amostra de tecido da mídia de troca de buffer e mergulhe-a na solução de coloração de anticorpos. Incubar tecidos individualmente por uma semana a 32 graus Celsius, balançando suavemente os tubos em uma posição de pé longe da luz. Mova as amostras de tecido para quatro graus Celsius, e incuba em posição de pé.
Depois de resfriar o tampão de lavagem de imunossuagem HV1 3D a quatro graus Celsius, lave a amostra com 15 mililitros de tampão duas vezes a quatro graus Celsius por 30 minutos, cada um com suave agitação em uma posição horizontal. Diluir a formalina para 1% no amortecedor de lavagem de imunossuagem HV1 3D, e imergir a amostra em oito mililitros da solução por 24 horas a quatro graus Celsius, com agitação suave. Agora, incubar a amostra em uma solução fresca de 1%formalina por uma hora a 37 graus Celsius, e lavar em 15 mililitros de PBS por duas horas a 25 graus Celsius.
Mergulhe órgãos transparentes em um tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de 50% de água diluída SOLUÇÃO CUBIC-R+à temperatura ambiente, com agitação suave. Substitua-o por cinco mililitros 100% CUBIC-R+e incubar com agitação suave por dois dias. Seque os tecidos usando Kimwipes e, em seguida, transfira-os para cinco mililitros de solução de montagem em uma placa de cultura de seis poços, e incuba-os à temperatura ambiente.
Adere os tecidos ao suporte da amostra de microscópio usando super cola gel. Mergulhe as amostras no microscópio de quartzo cuvette preenchido com 120 mililitros de solução de montagem. Imagem-os transversalmente ao seu eixo longitudinal, e adere ao coração, com o ápice e a aorta horizontalmente alinhados.
3D reconstruído O coração infectado por Trypanosoma cruzi apresentou uma maior proporção de células infectadas no átrio, em comparação com ventrículos. Parasitas dormentes podem ser identificados no coração, como descrito nos insets 3D aumentados. As células T que expressam ZsGreen1, bem como as células infectadas pelo Trypanosoma cruzi, foram visualizadas no músculo esquelético de um rato repórter CD8 infectado com Trypanosoma cruzi.
Zoom-ins 3D de imagem reconstruída em 3D identificaram células T na região de uma célula infectada. A interface das células T em células infectadas pelo hospedeiro foi visualizada por microscopia confocal. No coração de um camundongo imunodeficente, foram detectadas células hospedeiras infectadas com duas cepas diferentes de Trypanosoma cruzi, e o corte através dos tecidos mostrou abundantes células infectadas por parasitas no coração atria em várias profundidades teciduais.
A imunodecalça da vasculatura em Trypanosoma cruzi-infected e coração limpo revela a vasculatura intrincada do coração. Células infectadas por parasitas podem ser observadas no coração atria. A coloração nuclear do músculo esquelético mostrou um acúmulo de núcleos em áreas com poucos ou indetectáveis parasitas tdTomato.
O aumento dos marcadores de repórteres de parasitas tdTomato e GFP com anticorpos contra RFP e GFP, e músculo esquelético totalmente limpo resultou em forte fluorescência. Assim, os pontos críticos são o tempo de incubação no buffer CUBIC, o tempo de diluição e incubação no corante de DNA, o tempo de incubação nos anticorpos e o tempo de incubação na solução refratada de correspondência de índices. O uso de manchas adicionais, com corante de anticorpos específicos e reação rápida, poderia aumentar significativamente o potencial dessa técnica, permitindo a detecção de múltiplas células, processos e estrutura em órgãos intactos.
Agora temos uma maneira melhor e mais completa de explorar as células imunes responsáveis pela morte dos parasitas, os tecidos onde os parasitas persistem cronicamente, e a distribuição das drogas específicas nos tecidos.
