Questa tecnica ha fornito un'immagine più completa e 3D di interi organi trasparenti ed è stata utile per la quantificazione, non solo delle cellule replicanti, ma anche di parassiti dormienti e dei fattori immunitari. Questa tecnica ci consente di determinare l'associazione speciale di parassiti, cellule immunitarie e danni tissutali derivanti dall'infezione. Anche l'immunocolorazione degli epitopi e l'etichettatura del DNA erano paragonabili a questa tecnica.
Questo protocollo è stato efficacemente utilizzato per valutare i risultati del trattamento in modelli murini della malattia di Chagas. Un trattamento di dosi individuali più elevate, somministrato meno frequentemente per un periodo di trattamento prolungato, elimina sia i parassiti replicanti che quelli dormienti. A dimostrare la procedura sarà Caleb Hawkins, un tecnico di ricerca del laboratorio di Rick Tarleton.
Dopo l'eutanasia, la dissezione e la fissazione degli organi di un topo infetto come descritto nel manoscritto, immergere i singoli organi in 10 millilitri di CUBIC-L diluito al 50% in acqua, con un leggero scuotimento a temperatura ambiente in tubi conici da 50 millilitri durante la notte protetti dalla luce. Il giorno successivo, sostituire 50% CUBIC-L con 10 millilitri di 100% CUBIC-L e incubare per sei giorni a 37 gradi Celsius, mantenendo il tubo piatto sull'incubatore dello shaker. Alla fine di questo periodo di incubazione, i tessuti dovrebbero essere quasi completamente trasparenti.
Lavare gli organi trasparenti due volte con PBS per due ore a 37 gradi Celsius, con un leggero scuotimento. Ad ogni lavaggio, trasferire i tessuti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri per rimuovere Triton X-100. Per la colorazione del DNA, diluire il colorante di acido nucleico disponibile in commercio in cinque millilitri di tampone colorante a 1:2, 500.
Quindi, immergere il tessuto in un tubo conico da 15 millilitri contenente una soluzione di colorante nucleare e incubare a 37 gradi Celsius, con una leggera rotazione per cinque giorni in posizione eretta. Lavare il tessuto tre volte con 15 millilitri di tampone di lavaggio 3D per due ore a temperatura ambiente, con un leggero scuotimento. Calcolare la quantità richiesta di anticorpi primari e secondari.
Mescolare anticorpi primari e secondari in un tubo ambrato da due millilitri e incubare a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Per lo scambio di tampone, mescolare 7,5 millilitri di 2x tampone immunocolorante HV1 3D con 7,5 millilitri di acqua bidistillata. Immergere il campione di tessuto nel tampone e incubare per 1,5 ore a 32 gradi Celsius, agitando delicatamente in un tubo conico da 15 millilitri in posizione orizzontale.
Raccogliere il campione di tessuto dal mezzo di scambio tampone e immergerlo nella soluzione di colorazione anticorpale. Incubare i tessuti individualmente per una settimana a 32 gradi Celsius, scuotendo delicatamente i tubi in posizione eretta lontano dalla luce. Spostare i campioni di tessuto a quattro gradi Celsius e incubare in posizione eretta.
Dopo aver raffreddato il tampone immunocolorante HV1 3D a quattro gradi Celsius, lavare il campione con 15 millilitri di tampone due volte a quattro gradi Celsius per 30 minuti, ciascuno con un leggero agitazione in posizione orizzontale. Diluire la formalina all'1% in tampone di lavaggio immunocolorante HV1 3D e immergere il campione in otto millilitri della soluzione per 24 ore a quattro gradi Celsius, con un leggero scuotimento. Ora, incubare il campione in soluzione fresca di formalina all'1% per un'ora a 37 gradi Celsius e lavare in 15 millilitri di PBS per due ore a 25 gradi Celsius.
Immergere organi trasparenti in un tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione CUBIC-R+ diluita al 50% di acqua a temperatura ambiente, agitando delicatamente. Sostituirlo con cinque millilitri 100% CUBIC-R + e incubare con agitazione delicata per due giorni. Asciugare i tessuti usando Kimwipes, quindi trasferirli in cinque millilitri di soluzione di montaggio in una piastra di coltura a sei pozzetti e incubarli a temperatura ambiente.
Far aderire i tessuti al supporto del campione del microscopio usando la super colla in gel. Immergere i campioni nella cuvetta di quarzo del microscopio riempita con 120 millilitri di soluzione di montaggio. Immaginateli trasversalmente al loro asse longitudinale e fate aderire il cuore, con l'apice e l'aorta allineati orizzontalmente.
Il cuore infetto da Trypanosoma cruzi ricostruito in 3D ha mostrato una percentuale maggiore di cellule infette nell'atrio, rispetto ai ventricoli. I parassiti dormienti possono essere identificati nel cuore, come raffigurato nei riquadri ingranditi in 3D. Le cellule T che esprimono ZsGreen1, così come le cellule infette da Trypanosoma cruzi, sono state visualizzate nel muscolo scheletrico da un topo reporter CD8 infetto da Trypanosoma cruzi.
Gli zoom 3D dell'immagine ricostruita in 3D hanno identificato le cellule T nella regione di una cellula infetta. L'interfaccia delle cellule T nelle cellule infettate dall'ospite è stata visualizzata mediante microscopia confocale. Nel cuore di un topo immunodeficiente, sono state rilevate cellule ospiti infettate da due diversi ceppi di Trypanosoma cruzi e il taglio attraverso i tessuti ha mostrato abbondanti cellule infette da parassiti negli atri cardiaci a varie profondità tissutali.
L'immunorilevazione della vascolarizzazione nel cuore infetto e cancellato da Trypanosoma cruzi rivela l'intricata vascolarizzazione del cuore. Le cellule infettate da parassiti potrebbero essere osservate negli atri cardiaci. La colorazione nucleare del muscolo scheletrico ha mostrato un accumulo di nuclei in aree con pochi o non rilevabili parassiti tdTomato.
L'aumento dei marcatori reporter parassiti tdTomato e GFP con anticorpi contro RFP e GFP e l'intero muscolo scheletrico eliminato ha provocato una forte fluorescenza. Quindi i punti critici sono il tempo di incubazione nel tampone CUBICO, il tempo di diluizione e incubazione nel colorante del DNA, il tempo di incubazione negli anticorpi e il tempo di incubazione nella soluzione di corrispondenza dell'indice rifratto. L'uso di colorazione aggiuntiva, con coloranti anticorpali specifici e reazione rapida, potrebbe aumentare significativamente il potenziale di questa tecnica, consentendo la rilevazione di più cellule, processi e strutture in organi intatti.
Ora abbiamo un modo migliore e più completo per esplorare le cellule immunitarie responsabili dell'uccisione dei parassiti, i tessuti in cui i parassiti persistono cronicamente e la distribuzione dei farmaci specifici nei tessuti.
