Bu teknik, tüm şeffaf organların daha eksiksiz ve 3D bir görüntüsünü sağladı ve sadece çoğaltmanın değil, aynı zamanda uykudaki parazit ve bağışıklık faktörü hücrelerinin de nicelleştirilmesi için yararlı oldu. Bu teknik, parazitlerin, bağışıklık hücrelerinin ve enfeksiyondan kaynaklanan doku hasarının özel ilişkisini belirlememizi sağlar. Epitop immün boyama ve DNA etiketleme de bu teknikle karşılaştırılabilirdi.
Bu protokol, Chagas hastalığının fare modellerinde tedavi sonuçlarını değerlendirmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Uzun bir tedavi süresi boyunca daha az sıklıkta verilen daha yüksek bireysel dozların tedavisi, hem çoğalan hem de uykuda olan parazitleri ortadan kaldırır. Prosedürü gösteren, Rick Tarleton'un laboratuvarından bir araştırma teknisyeni olan Caleb Hawkins olacak.
Enfekte bir farenin organlarını el yazmasında açıklandığı gibi ötenazi, diseke ve sabitledikten sonra, bireysel organları 10 mililitre% 50 su ile seyreltilmiş CUBIC-L'ye batırın, gece boyunca ışıktan korunan 50 mililitrelik konik tüplerde oda sıcaklığında hafifçe sallayın. Ertesi gün,% 50 CUBIC-L'yi 10 mililitre% 100 CUBIC-L ile değiştirin ve tüpü çalkalayıcı inkübatöründe düz tutarken altı gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu kuluçka süresinin sonunda, dokular neredeyse tamamen şeffaf olmalıdır.
Şeffaf organları PBS ile iki kez 37 santigrat derecede iki saat boyunca hafifçe sallayarak yıkayın. Her yıkamada, Triton X-100'ü çıkarmak için dokuları yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. DNA boyama için, ticari olarak temin edilebilen nükleik asit boyasını beş mililitre boyama tamponunda 1:2.500'de seyreltin.
Daha sonra, dokuyu nükleer boya çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe batırın ve ayakta durma pozisyonunda beş gün boyunca yumuşak bir rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Dokuyu 15 mililitre 3D nükleer boyama yıkama tamponu ile oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe çalkalayarak üç kez yıkayın. Gerekli miktarda birincil ve ikincil antikor hesaplayın.
Birincil ve ikincil antikorları amber iki mililitrelik bir tüpte karıştırın ve 1.5 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tampon değişimi için, 7,5 mililitre 2x HV1 3D immün boyama tamponunu 7,5 mililitre çift damıtılmış su ile karıştırın. Doku örneğini tampona batırın ve yatay konumda 15 mililitrelik bir konik tüpte hafifçe sallanarak 32 santigrat derecede 1,5 saat boyunca inkübe edin.
Doku örneğini tampon değişim ortamından toplayın ve antikor boyama çözeltisine batırın. Dokuları bir hafta boyunca 32 santigrat derecede ayrı ayrı inkübe edin, tüpleri ışıktan uzakta ayakta duran bir konumda hafifçe sallayın. Doku örneklerini dört santigrat dereceye taşıyın ve ayakta dururken inkübe edin.
HV1 3D immün boyama yıkama tamponunu dört santigrat dereceye kadar soğuttuktan sonra, numuneyi her biri yatay konumda hafifçe sallanan 30 dakika boyunca dört santigrat derecede iki kez 15 mililitre tamponla yıkayın. Formalini HV1 3D immün boyama yıkama tamponunda% 1'e kadar seyreltin ve numuneyi dört santigrat derecede 24 saat boyunca çözeltinin sekiz mililitresine hafifçe sallayarak batırın. Şimdi, numuneyi 37 santigrat derecede bir saat boyunca taze% 1formalin çözeltisinde inkübe edin ve 25 santigrat derecede iki saat boyunca 15 mililitre PBS'de yıkayın.
Şeffaf organları, oda sıcaklığında beş mililitre %50 su ile seyreltilmiş CUBIC-R+solüsyonu içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe hafifçe çalkalayarak daldırın. Beş mililitre% 100 CUBIC-R + ile değiştirin ve iki gün boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Kimwipes'i kullanarak dokuları kurutun ve ardından altı delikli bir kültür plakasında beş mililitre montaj çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında inkübe edin.
Dokuları jel süper yapıştırıcı kullanarak mikroskop numune tutucusuna yapıştırın. Numuneleri 120 mililitre montaj çözeltisi ile doldurulmuş mikroskop kuvars küvete batırın. Onları uzunlamasına eksenlerine enine olarak görüntüleyin ve tepesi ve aortu yatay olarak hizalanmış olarak kalbe yapıştırın.
3D yeniden yapılandırılmış Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş kalp, ventriküllere kıyasla atriyumda enfekte olmuş hücrelerin daha yüksek bir oranını gösterdi. Uyuyan parazitler, 3D genişlemiş insets'te gösterildiği gibi kalpte tanımlanabilir. ZsGreen1 eksprese eden T hücrelerinin yanı sıra Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş hücreler, Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş bir CD8 muhabir faresinden iskelet kasında görselleştirildi.
3D yeniden yapılandırılmış görüntünün 3D yakınlaştırmaları, enfekte olmuş bir hücrenin bölgesindeki T hücrelerini tanımladı. Konakçı ile enfekte hücrelerdeki T hücrelerinin arayüzü konfokal mikroskopi ile görselleştirildi. İmmün yetmezlikli bir farenin kalbinde, iki farklı Trypanosoma cruzi suşu ile enfekte olmuş konakçı hücreler tespit edildi ve dokulardan dilimleme, kalp atriyumunda çeşitli doku derinliklerinde bol miktarda parazitle enfekte olmuş hücre gösterdi.
Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş ve temizlenmiş kalpte vaskülatürün immün tespiti, kalbin karmaşık vaskülatürünü ortaya çıkarır. Parazitle enfekte olmuş hücreler kalp atriyumunda gözlenebilir. İskelet kasının nükleer boyanması, az sayıda veya tespit edilemeyen tdDomates paraziti olan bölgelerde çekirdek birikimi gösterdi.
TdDomates ve GFP parazit muhabiri belirteçlerinin RFP ve GFP'ye karşı antikorlarla ve tüm temizlenmiş iskelet kasının güçlendirilmesi güçlü floresan ile sonuçlandı. Bu nedenle kritik noktalar KÜBİK tampondaki inkübasyon süresi, DNA boyasındaki seyreltme ve inkübasyon süresi, antikorlardaki inkübasyon süresi ve kırılan indeks eşleştirme çözeltisindeki inkübasyon süresidir. Spesifik antikorlar boyası ve hızlı reaksiyon ile ek boyama kullanımı, bu tekniğin potansiyelini önemli ölçüde artırabilir ve sağlam organlarda çoklu hücrelerin, süreçlerin ve yapının tespit edilmesine izin verebilir.
Artık parazitleri öldürmekten sorumlu bağışıklık hücrelerini, parazitlerin kronik olarak devam ettiği dokuları ve spesifik ilaçların dokulara dağılımını keşfetmek için daha iyi ve daha eksiksiz bir yolumuz var.
