قدمت هذه التقنية صورة أكثر اكتمالا و 3D للأعضاء الشفافة بأكملها وكانت مفيدة للقياس الكمي ، ليس فقط من التكرار ، ولكن أيضا من الطفيليات النائمة وخلايا العامل المناعي. تسمح لنا هذه التقنية بتحديد الارتباط الخاص للطفيليات والخلايا المناعية وتلف الأنسجة الناتج عن العدوى. كما كان تلطيخ المناعة Epitope ووضع العلامات على الحمض النووي قابلا للمقارنة مع هذه التقنية.
تم استخدام هذا البروتوكول بشكل فعال لتقييم نتائج العلاج في نماذج الفئران لمرض شاغاس. علاج جرعات فردية أعلى ، تعطى بشكل أقل تواترا على مدى فترة علاج ممتدة ، يزيل كل من الطفيليات المكررة والخاملة. وسيوضح الإجراء كاليب هوكينز، وهو فني أبحاث من مختبر ريك تارلتون.
بعد القتل الرحيم والتشريح وتثبيت أعضاء الفأر المصاب كما هو موضح في المخطوطة ، اغمر الأعضاء الفردية في 10 ملليلتر من CUBIC-L المخفف بالماء بنسبة 50٪ ، مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر بين عشية وضحاها محمية من الضوء. في اليوم التالي ، استبدل 50٪ CUBIC-L ب 10 ملليلتر من 100٪ CUBIC-L ، واحتضن لمدة ستة أيام عند 37 درجة مئوية ، مع الحفاظ على الأنبوب مسطحا على حاضنة الاهتزاز. في نهاية فترة الحضانة هذه ، يجب أن تكون الأنسجة شفافة تماما تقريبا.
اغسل الأعضاء الشفافة مرتين باستخدام PBS لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، مع اهتزاز لطيف. مع كل غسلة ، انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر لإزالة Triton X-100. لتلطيخ الحمض النووي ، قم بتخفيف صبغة الحمض النووي المتاحة تجاريا في خمسة ملليلترات من مخزن التلطيخ العازل في 1: 2 ، 500.
ثم ، اغمر الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على محلول صبغة نووية ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية ، مع دوران لطيف لمدة خمسة أيام في وضع الوقوف. اغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام 15 ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل ثلاثي الأبعاد للتلطيخ النووي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز لطيف. احسب الكمية المطلوبة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
امزج الأجسام المضادة الأولية والثانوية في أنبوب كهرماني سعة ملليلترين ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. لتبادل المخزن المؤقت ، امزج 7.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للبقع المناعية HV1 3D 2x مع 7.5 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج. اغمر عينة الأنسجة في المخزن المؤقت ، واحتضنها لمدة 1.5 ساعة عند 32 درجة مئوية ، مع اهتزاز لطيف في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر في وضع أفقي.
اجمع عينة الأنسجة من وسائط التبادل العازلة ، واغمرها في محلول تلطيخ الأجسام المضادة. احتضن الأنسجة بشكل فردي لمدة أسبوع واحد عند 32 درجة مئوية ، وهز الأنابيب بلطف في وضع الوقوف بعيدا عن الضوء. انقل عينات الأنسجة إلى أربع درجات مئوية ، واحتضنها في وضع الوقوف.
بعد تبريد المخزن المؤقت للغسيل المناعي HV1 3D إلى أربع درجات مئوية ، اغسل العينة ب 15 ملليلتر من المخزن المؤقت مرتين عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع اهتزاز لطيف في وضع أفقي. قم بتخفيف الفورمالين إلى 1٪ في المخزن المؤقت للغسيل المناعي HV1 3D ، واغمر العينة في ثمانية ملليلترات من المحلول لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية ، مع اهتزاز لطيف. الآن ، احتضن العينة في محلول فورمالين طازج بنسبة 1٪ لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، واغسلها في 15 ملليلتر من PBS لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية.
اغمر الأعضاء الشفافة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من محلول CUBIC-R + المخفف بالماء بنسبة 50٪ في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز لطيف. استبدله بخمسة ملليلتر 100٪ CUBIC-R + واحتضنه باهتزاز لطيف لمدة يومين. جفف الأنسجة باستخدام كيمويبس ، ثم انقلها إلى خمسة ملليلترات من محلول التركيب في لوحة استزراع من ستة آبار ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة.
قم بلصق الأنسجة بحامل عينة المجهر باستخدام الغراء الفائق الهلام. اغمر العينات في كوفيت كوارتز المجهر المملوء ب 120 ملليلتر من محلول التركيب. صورها بشكل عرضي إلى محورها الطولي ، والتزم بالقلب ، مع محاذاة القمة والشريان الأورطي أفقيا.
أظهر القلب المصاب بالمثقبيات المصابة بداء المثقبيات 3D نسبة أعلى من الخلايا المصابة في الأذين ، مقارنة بالبطينين. يمكن تحديد الطفيليات النائمة في القلب ، كما هو موضح في insets 3D الموسعة. تم تصوير الخلايا التائية المعبرة عن ZsGreen1 ، وكذلك الخلايا المصابة بالمثقبيات الكروزي ، في العضلات الهيكلية من فأر مراسل CD8 مصاب ب Trypanosoma cruzi.
حددت التكبيرات ثلاثية الأبعاد للصورة المعاد بناؤها 3D الخلايا التائية في منطقة الخلية المصابة. تم تصور واجهة الخلايا التائية في الخلايا المصابة بالمضيف بواسطة المجهر البؤري. في قلب فأر يعاني من نقص المناعة ، تم اكتشاف الخلايا المضيفة المصابة بسلالتين مختلفتين من Trypanosoma cruzi ، وأظهر التقطيع عبر الأنسجة خلايا وفيرة مصابة بالطفيليات في أذينين القلب على أعماق الأنسجة المختلفة.
الكشف المناعي للأوعية الدموية في المثقبيات كروزي المصابة والقلب الصافي يكشف عن الأوعية الدموية المعقدة للقلب. يمكن ملاحظة الخلايا المصابة بالطفيليات في أذينين القلب. أظهر التلطيخ النووي للعضلات الهيكلية تراكم النوى في المناطق التي بها عدد قليل من طفيليات الطماطم أو التي لا يمكن اكتشافها.
أدى تعزيز علامات مراسل الطفيليات tdTomato و GFP مع الأجسام المضادة ضد RFP ، و GFP ، والعضلات الهيكلية الكاملة التي تم تطهيرها إلى تألق قوي. لذا فإن النقاط الحرجة هي وقت الحضانة في المخزن المؤقت المكعب ، ووقت التخفيف والحضانة في صبغة الحمض النووي ، ووقت الحضانة في الأجسام المضادة ، ووقت الحضانة في محلول مطابقة المؤشر المنكسر. يمكن أن يؤدي استخدام تلطيخ إضافي ، مع صبغة أجسام مضادة محددة ورد فعل سريع ، إلى زيادة كبيرة في إمكانات هذه التقنية ، مما يسمح بالكشف عن خلايا وعمليات وبنية متعددة في الأعضاء السليمة.
لدينا الآن طريقة أفضل وأكثر اكتمالا لاستكشاف الخلايا المناعية المسؤولة عن قتل الطفيليات ، والأنسجة التي تستمر فيها الطفيليات بشكل مزمن ، وتوزيع الأدوية المحددة في الأنسجة.
