Этот метод обеспечил более полное и 3D-изображение целых прозрачных органов и был полезен для количественной оценки не только реплицирующихся, но и спящих паразитов и клеток иммунного фактора. Этот метод позволяет определить особую ассоциацию паразитов, иммунных клеток и повреждения тканей в результате инфекции. Эпитопное иммуноокрашивание и маркировка ДНК также были сопоставимы с этой техникой.
Этот протокол эффективно использовался для оценки результатов лечения на мышиных моделях болезни Шагаса. Лечение более высокими индивидуальными дозами, назначаемыми реже в течение длительного периода лечения, устраняет как реплицирующихся, так и спящих паразитов. Продемонстрировать процедуру будет Калеб Хокинс, техник-исследователь из лаборатории Рика Тарлтона.
После эвтаназии, вскрытия и фиксации органов инфицированной мыши, как описано в рукописи, погружайте отдельные органы в 10 миллилитров 50% разбавленного водой CUBIC-L, с легким встряхиванием при комнатной температуре в 50-миллилитровых конических трубках, защищенных ночью от света. На следующий день замените 50% CUBIC-L на 10 миллилитров 100% CUBIC-L и инкубируйте в течение шести дней при 37 градусах Цельсия, сохраняя трубку плоской на шейкерном инкубаторе. В конце этого инкубационного периода ткани должны быть практически полностью прозрачными.
Промыть прозрачные органы дважды PBS в течение двух часов при 37 градусах Цельсия, с легким встряхиванием. С каждой промывкой переносите ткани в новую 50-миллилитровую коническую трубку для удаления Triton X-100. Для окрашивания ДНК разбавляют коммерчески доступный краситель нуклеиновой кислоты в пяти миллилитрах буфера окрашивания при 1:2, 500.
Затем погружают ткань в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую раствор ядерного красителя, и инкубируют при 37 градусах Цельсия, с мягким вращением в течение пяти дней в положении стоя. Промыть ткань три раза 15 миллилитрами 3D ядерного окрашивания в течение двух часов при комнатной температуре, с легким встряхиванием. Рассчитайте необходимое количество первичных и вторичных антител.
Смешайте первичные и вторичные антитела в янтарной двухмиллилитровой трубке и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 1,5 часов. Для буферного обмена смешайте 7,5 миллилитров 2x HV1 3D иммуноразрушающего буфера с 7,5 миллилитрами двухдистиллированной воды. Погрузить образец ткани в буфер и инкубировать в течение 1,5 часов при 32 градусах Цельсия, с легким встряхиванием в 15-миллилитровой конической трубке в горизонтальном положении.
Соберите образец ткани из буферной обменной среды и погрузите его в раствор для окрашивания антител. Инкубируйте ткани индивидуально в течение одной недели при температуре 32 градуса Цельсия, осторожно встряхивая трубки в стоячем положении в сторону от света. Переместите образцы тканей на четыре градуса Цельсия и высиживайте в положении стоя.
После охлаждения HV1 3D иммуноокрашивающего промывочного буфера до четырех градусов Цельсия промыть образец 15 миллилитрами буфера дважды при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, каждый с легким встряхиванием в горизонтальном положении. Разбавить формалин до 1% в HV1 3D иммуноокрашивающий промывочный буфер и погрузить образец в восемь миллилитров раствора на 24 часа при четырех градусах Цельсия, с легким встряхиванием. Теперь инкубируйте образец в свежем 1% растворе формалина в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и промывайте в 15 миллилитрах PBS в течение двух часов при 25 градусах Цельсия.
Погрузите прозрачные органы в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров 50% разбавленного водой раствора CUBIC-R+при комнатной температуре, с легким встряхиванием. Замените его пятью миллилитрами 100% CUBIC-R+ и высиживайте с легким встряхиванием в течение двух дней. Высушите ткани с помощью Kimwipes, а затем переложите их на пять миллилитров монтажного раствора в шестилуночной культуральной пластине, и инкубируйте их при комнатной температуре.
Приклейте ткани к держателю образца микроскопа с помощью геля суперклея. Погрузите образцы в кварцевую кювету микроскопа, заполненную 120 миллилитрами монтажного раствора. Изобразите их поперечно к их продольной оси и приклейте сердце, с вершиной и аортой горизонтально выровненными.
3D-реконструированное Trypanosoma cruzi-инфицированное сердце показало более высокую долю инфицированных клеток в предсердиях по сравнению с желудочками. Спящие паразиты могут быть идентифицированы в сердце, как изображено в 3D-увеличенных вставках. ZsGreen1-экспрессирующие Т-клетки, а также инфицированные Trypanosoma cruzi клетки были визуализированы в скелетных мышцах у мыши-репортера CD8, инфицированной Trypanosoma cruzi.
3D-увеличение 3D-реконструированного изображения идентифицировало Т-клетки в области инфицированной клетки. Интерфейс Т-клеток в клетках, инфицированных хозяином, был визуализирован с помощью конфокальной микроскопии. В сердце иммунодефицитной мыши были обнаружены клетки-хозяева, инфицированные двумя различными штаммами Trypanosoma cruzi, и разрезание тканей показало обильное присутствие инфицированных паразитами клеток в сердечных предсердиях на различных глубинах тканей.
Иммунодетекция сосудистой системы при Trypanosoma cruzi-инфицированном и очищенном сердце выявляет сложную сосудистую систему сердца. Инфицированные паразитами клетки могут наблюдаться в предсердиях сердца. Ядерное окрашивание скелетных мышц показало накопление ядер в областях с небольшим количеством или неопределяемыми паразитами tdTomato.
Повышение маркеров репортеров паразитов tdTomato и GFP антителами против RFP и GFP и целых очищенных скелетных мышц привело к сильной флуоресценции. Таким образом, критическими точками являются время инкубации в буфере CUBIC, время разбавления и инкубации в красителе ДНК, время инкубации в антителах и время инкубации в преломленном растворе, соответствующем индексу. Использование дополнительного окрашивания со специфическим красителем антител и быстрой реакцией может значительно увеличить потенциал этой техники, позволяя обнаруживать множественные клетки, процессы и структуру в неповрежденных органах.
Теперь у нас есть лучший и более полный способ исследовать иммунные клетки, ответственные за уничтожение паразитов, ткани, где паразиты сохраняются хронически, и распределение конкретных лекарств в тканях.
