השיטה שלנו מספקת דרך מהירה להבין את ההשפעה התפקודית של וריאנטים ב- Ube3a, אוביקוויטין ליגאז שגורם לתסמונת אנג'למן וקשור מאוד לצורה גנטית של אוטיזם המכונה תסמונת Dup15q. האפיון של פעילות הליגאז של יוביקוויטין הוא באופן מסורתי אינטנסיבי ואיטי, ושיטות כאלה קשות ולא ממש מקובלות לאפיין את מאות הווריאנטים שזוהו עבור Ube3a. תסמונת אנג'למן נגרמת על ידי מחיקת הגן האימהי Ube3a, ואילו תסמונת Dup15q נגרמת על ידי שכפול של Ube3a האימהית, ולכן חשוב להסיק כיצד וריאנטים שגויים שינו את הפעילות של האנזים Ube3a, וזה משהו שקשה לעשות מבלי לבדוק אמפירית כל וריאנט.
מי שתדגים את ההליך תהיה ג'אלין סטלצר, טכנאית מחקר במעבדה שלי. התחילו בביצוע הבדיקות בתאי HEK293T, שגודלו במדיום הנשר המתוקן של דולבקו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו-חמצני במיכל לח, כפי שמתואר בכתב היד. בארון בטיחות ביולוגית, צלחת את תאי HEK293T המרחפים על צלחת 96 בעלת תחתית שטוחה שטופלה בתרבית רקמה ודגירה של התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות.
ביום השני, העבירו את התאים בארון בטיחות ביולוגית עם פלסמידים של פיירפליי ורנילה לוציפראז, ופלסמידים של Ube3a במשולש. בצע את הטרנספקציות בנפח כולל של 10 מיקרוליטר לבאר. צור תערובת מאסטר עבור הטרנספקציות עבור כל גרסה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
לאחר הדגירה, התסיסו בעדינות את תערובת הטרנספקציה על ידי הקשה על הצינור, ולאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת הטרנספקציה ישירות למדיית הצמיחה הקיימת בבארות. לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לפלסמידים להתבטא במשך 48 שעות. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, עקוב אחר יעילות הטרנספקציה על ידי פלואורסצנציה של GFP.
יותר מ-80% מהתאים צריכים לבטא GFP לאחר 48 שעות. שאפו בזהירות את מדיית התרבית מתאי HEK293T שעברו טרנספקציה ולאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS קר. שאפו את ה-PBS.
הוסיפו 25 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס שאינו דנטורינג עבור תזה של תאים, ודגרו במשך 15 דקות על קרח עם נדנדה עדינה. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של הליזאט המתקבל לצלחת בדיקה חדשה בת 96 בארות המכילה 100 מיקרוליטרים של מגיב מצע Firefly luciferase, וערבבו את הצלחת בעדינות על ידי הקשה. טען את הלוח לקורא צלחות ומדוד את עוצמת האור באמצעות גלאי עליון עם גובה קריאה של מילימטר אחד וזמן אינטגרציה של שנייה אחת.
מיד לאחר קריאת ה- Firefly luciferase luminescence, הוסף 100 מיקרוליטרים של מצע Renilla luciferase לבארות, אשר מרווה את פעילות לוציפראז Firefly תוך הערכת פעילות רנילה לוציפראז. מערבבים את הדגימות על ידי תסיסה עדינה בצלחת ומודדים שוב את הלומינסנציה כדי להעריך את פעילות הרנילה לוציפראז. השווה את הפעילות היחסית של חלבונים משתנים על ידי כימות תגובות המדווחים ונרמול ערך Firefly ו- Renilla עבור כל וריאנט כנגד הסוג הפראי Ube3a.
תאי HEK293T שעברו טרנספקציה עם כמויות הולכות וגדלות של קידוד פלסמידים מסוג פראי מסוג Ube3a מראים עלייה ליניארית בתגובת BAR. בדיקת BAR מזהה גרסאות הקשורות למחלה של הפלסמידים, ומדגימה את הדיוק והכלליות של שיטה זו. מסך בדיקת BAR עבור 152 גרסאות Ube3a מציג אובדן שפיר של תפקוד ורווח של מוטציות פונקציה ביחס ל- Ube3a מסוג פראי.
הרווח של החלפת פונקציה גלוטמט, אובדן החלפת פרולין פונקציה, ואובדן נוסף של החלפת פונקציה ארגינין בעמדה 588 של Ube3a יצרו השפעות שונות באופן דרסטי, ובכך הדגישו את החשיבות של הערכת וריאנטים אמפיריים. עלילת החום מראה תוצאות BAR מנורמלות לניתוח מוטציות מקיף בעמדה 588 ב- Ube3a. ההצללה הלבנה מייצגת רמות פעילות של Ube3a מסוג פראי, ההצללה הכחולה מציינת אובדן תפקוד, וההצללה האדומה מציינת רווח של מוטציות פונקציה.
מעבר להשלכות הקליניות של עבודתנו, Ube3a היא חברה במשפחת תחומי HECT של ליגאזות יוביקוויטין, אשר כולן בעלות התחום הקטליטי HECT המשומר. ואני חושב שאחד ההיבטים המרתקים של העבודה שלנו הוא שהיא מספקת נתונים עשירים של פונקציות מבנה על Ube3a, וניתן להשתמש בזה כדי להשיג הבנה מכניסטית עמוקה יותר עבור סוג זה של אנזימים.
