توفر طريقتنا طريقة سريعة لفهم التأثير الوظيفي للمتغيرات في Ube3a ، وهو يوبيكويتين ليجاز يسبب متلازمة أنجلمان ويرتبط ارتباطا وثيقا بالشكل الجيني للتوحد المعروف باسم متلازمة Dup15q. عادة ما يكون توصيف نشاط يوبيكويتين ligase كثيف العمالة وبطيئا ، وهذه الأساليب صعبة وغير قابلة حقا لتوصيف مئات المتغيرات المحددة ل Ube3a. تحدث متلازمة أنجلمان بسبب حذف جين Ube3a الأمومي ، بينما تحدث متلازمة Dup15q بسبب تكرار Ube3a للأم ، لذلك من المهم استنتاج كيف غيرت المتغيرات الخاطئة نشاط إنزيم Ube3a ، وهذا شيء يصعب القيام به دون اختبار تجريبي لكل متغير.
سيوضح الإجراء جالين ستيلزر ، فني أبحاث في مختبري. ابدأ بإجراء المقايسات في خلايا HEK293T ، المزروعة في وسط النسر المعدل في Dulbecco عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاوية رطبة ، كما هو موضح في المخطوطة. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بطلاء خلايا HEK293T المعلقة على صفيحة 96 ذات قاع مسطح معالج بزراعة الأنسجة واحتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة.
في اليوم الثاني ، قم بنقل الخلايا في خزانة السلامة الحيوية باستخدام بلازميدات مراسل Firefly و Renilla luciferase ، وبلازميدات Ube3a في ثلاث نسخ. أداء transfections في حجم إجمالي من 10 ميكرولتر لكل بئر. قم بإنشاء مزيج رئيسي لعمليات النقل لكل متغير في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة ، قم بتحريك خليط النقل برفق عن طريق النقر على الأنبوب ، ثم أضف 10 ميكرولتر من خليط النقل مباشرة إلى وسائط النمو الموجودة في الآبار. بعد ذلك ، أعد الخلايا إلى الحاضنة واسمح للبلازميدات بالتعبير لمدة 48 ساعة. باستخدام مجهر مضان ، راقب كفاءة النقل بواسطة مضان GFP.
يجب أن تعبر أكثر من 80٪ من الخلايا عن GFP بعد 48 ساعة. استنشاق وسائط الاستزراع بعناية من خلايا HEK293T المنقولة ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS البارد. نضح برنامج تلفزيوني.
أضف 25 ميكرولترا من محلول التحلل غير المسخ لتحلل الخلايا ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة على الجليد مع هزاز لطيف. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المحللة الناتجة إلى لوحة فحص جديدة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من كاشف ركيزة Firefly luciferase ، واخلط اللوحة برفق عن طريق النقر. قم بتحميل اللوحة لأسفل إلى قارئ لوحة وقم بقياس التلألؤ باستخدام كاشف علوي بارتفاع قراءة يبلغ ملليمترا واحدا ووقت تكامل يبلغ ثانية واحدة.
مباشرة بعد قراءة تلألؤ لوسيفيراز اليراع ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة رينيلا لوسيفيراز إلى الآبار ، والتي تروي نشاط لوسيفيراز اليراع أثناء تقييم نشاط لوسيفيراز رينيلا. امزج العينات عن طريق تحريض اللوح اللطيف وقياس التلألؤ مرة أخرى لتقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز. قارن النشاط النسبي للبروتينات المتغيرة عن طريق تحديد استجابات المراسل وتطبيع قيمة Firefly و Renilla لكل متغير مقابل النوع البري Ube3a.
تظهر خلايا HEK293T المنقولة بكميات متزايدة من تشفير البلازميد من النوع البري Ube3a زيادة خطية في استجابة BAR. يحدد اختبار BAR المتغيرات المرتبطة بالمرض من البلازميدات ، مما يدل على دقة وعمومية هذه الطريقة. تعرض شاشة فحص BAR ل 152 متغيرا من متغيرات Ube3a فقدانا حميدا للوظيفة واكتساب طفرات وظيفية بالنسبة إلى Ube3a من النوع البري.
أدى اكتساب استبدال الغلوتامات الوظيفية ، وفقدان استبدال البرولين الوظيفي ، وفقدان آخر لاستبدال الأرجينين الوظيفي في الموضع 588 من Ube3a إلى تأثيرات مختلفة بشكل جذري ، مما يؤكد أهمية التقييم المتغير التجريبي. يظهر مخطط الحرارة نتائج BAR الطبيعية للتحليل الطفري الشامل في الموضع 588 في Ube3a. يمثل التظليل الأبيض مستويات نشاط Ube3a من النوع البري ، ويشير التظليل الأزرق إلى فقدان الوظيفة ، ويشير التظليل الأحمر إلى اكتساب طفرات الوظيفة.
بالإضافة إلى الآثار السريرية لعملنا ، فإن Ube3a هي عضو في عائلة مجال HECT من أربطة ubiquitin ، والتي تمتلك جميعها المجال الحفاز HECT المحفوظ. وأعتقد أن أحد الجوانب الرائعة لعملنا هو أنه يوفر بيانات دالة بنية غنية حول Ube3a ، ويمكن استخدام هذا لاكتساب فهم ميكانيكي أعمق لهذه الفئة من الإنزيمات.
