Il nostro metodo fornisce un modo rapido per comprendere l'impatto funzionale delle varianti in Ube3a, una ubiquitina ligasi che causa la sindrome di Angelman ed è fortemente legata a una forma genetica di autismo nota come sindrome di Dup15q. La caratterizzazione dell'attività dell'ubiquitina ligasi è tradizionalmente laboriosa e lenta, e tali metodi sono difficili e non realmente suscettibili di caratterizzare le centinaia di varianti identificate per Ube3a. La sindrome di Angelman è causata dalla delezione del gene materno Ube3a, mentre la sindrome Dup15q è causata dalla duplicazione dell'Ube3a materno, quindi è importante dedurre come le varianti missenso abbiano cambiato l'attività dell'enzima Ube3a, e questo è qualcosa che è difficile da fare senza testare empiricamente ogni variante.
A dimostrare la procedura sarà Jalin Stelzer, un tecnico di ricerca nel mio laboratorio. Inizia eseguendo i saggi in cellule HEK293T, coltivate nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica in un contenitore umidificato, come descritto nel manoscritto. In un armadio di biosicurezza, placcare le cellule HEK293T sospese su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti trattata con colture tissutali e incubare le cellule durante la notte a 37 gradi.
Il secondo giorno, trasfettare le cellule in un armadio di biosicurezza con plasmidi reporter Firefly e Renilla luciferasi e plasmidi Ube3a in triplice copia. Eseguire le trasfezioni in un volume totale di 10 microlitri per pozzetto. Creare un master mix per le trasfezioni per ogni variante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, agitare delicatamente la miscela di trasfezione toccando il tubo, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela di trasfezione direttamente ai terreni di crescita esistenti nei pozzetti. Successivamente, riportare le cellule nell'incubatore e consentire ai plasmidi di esprimersi per 48 ore. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, monitorare l'efficienza della trasfezione mediante fluorescenza GFP.
Più dell'80% delle cellule dovrebbe esprimere GFP dopo 48 ore. Aspirare con cura i terreni di coltura dalle cellule HEK293T trasfettate e quindi lavare le cellule con PBS freddo. Aspirare il PBS.
Aggiungere 25 microlitri di tampone di lisi non denaturante per la lisi cellulare e incubare per 15 minuti sul ghiaccio con un leggero dondolio. Quindi, aggiungere 20 microlitri del lisato risultante in una nuova piastra di dosaggio a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di un reagente del substrato della luciferasi Firefly e mescolare delicatamente la piastra picchiettando. Caricare la piastra su un lettore di piastre e misurare la luminescenza utilizzando un rilevatore superiore con un'altezza di lettura di un millimetro e un tempo di integrazione di un secondo.
Immediatamente dopo aver letto la luminescenza della luciferasi Firefly, aggiungere 100 microlitri di substrato di Renilla luciferasi ai pozzetti, che estingue l'attività della luciferasi Firefly mentre valuta l'attività della Renilla luciferasi. Mescolare i campioni agitando delicatamente le piastre e misurare nuovamente la luminescenza per valutare l'attività della Renilla luciferasi. Confrontare l'attività relativa delle proteine varianti quantificando le risposte dei reporter e normalizzando il valore di Firefly e Renilla per ciascuna variante rispetto al wild type Ube3a.
Le cellule HEK293T trasfettate con quantità crescenti di plasmide che codifica Ube3a wild-type mostrano un aumento lineare della risposta BAR. Il test BAR identifica le varianti legate alla malattia dei plasmidi, dimostrando l'accuratezza e la generalità di questo metodo. Lo schermo del test BAR per 152 varianti di Ube3a mostra mutazioni benigne di perdita di funzione e guadagno di funzione rispetto all'Ube3a wild-type.
Il guadagno di funzione sostituzione del glutammato, la perdita di funzione sostituzione della prolina e un'altra perdita di funzione sostituzione dell'arginina alla posizione 588 di Ube3a hanno prodotto effetti drasticamente diversi, sottolineando così l'importanza della valutazione empirica delle varianti. Il grafico del calore mostra i risultati normalizzati della BAR per un'analisi mutazionale completa in posizione 588 in Ube3a. L'ombreggiatura bianca rappresenta i livelli di attività Ube3a wild-type, l'ombreggiatura blu indica la perdita di funzione e l'ombreggiatura rossa indica il guadagno delle mutazioni di funzione.
Al di là delle implicazioni cliniche del nostro lavoro, Ube3a è un membro della famiglia di ubiquitina ligasi del dominio HECT, che possiedono tutte il dominio catalitico HECT conservato. E penso che uno degli aspetti affascinanti del nostro lavoro sia che fornisce ricchi dati sulle funzioni di struttura su Ube3a, e questo può essere usato per ottenere una comprensione meccanicistica più profonda per questa classe di enzimi.
