一种可扩展的、基于细胞的 Ube3a 变体功能评估方法

我们的方法提供了一种快速了解Ube3a变异功能影响的方法，Ube3a是一种引起Angelman综合征的泛素连接酶，与称为Dup15q综合征的自闭症遗传形式密切相关。泛素连接酶活性的表征传统上是劳动密集型和缓慢的，并且这种方法很难并且不适合表征Ube3a鉴定的数百种变体。Angelman综合征是由母体Ube3a基因的缺失引起的，而Dup15q综合征是由母体Ube3a的重复引起的，因此推断错义变异如何改变Ube3a酶的活性非常重要，如果不对每个变异进行经验测试，这是很难做到的。

演示该程序的将是我实验室的研究技术人员Jalin Stelzer。首先在HEK293T细胞中进行测定，HEK293T细胞在Dulbecco的改良鹰培养基中生长，温度为37摄氏度，在加湿的容器中含有5%的二氧化碳，如手稿中所述。在生物安全柜中，将悬浮的HEK293T细胞接种到组织培养处理的96孔平底板上，并将细胞在37度下孵育过夜。

第二天，用萤火虫和雷尼拉荧光素酶报告质粒以及Ube3a质粒一式三份在生物安全柜中转染细胞。以每孔10微升的总体积进行转染。在 1.5 毫升微量离心管中为每个变体的转染创建预混液，并在室温下孵育 15 分钟。

孵育后，通过敲击管轻轻搅拌转染混合物，然后将10微升转染混合物直接添加到孔中现有的生长培养基中。之后，将细胞放回培养箱，让质粒表达48小时。使用荧光显微镜，通过GFP荧光监测转染效率。

超过80%的细胞应在48小时后表达GFP。小心地从转染的HEK293T细胞中吸出培养基，然后用冷PBS洗涤细胞。吸出 PBS。

加入25微升非变性裂解缓冲液用于细胞裂解，并在冰上轻轻摇动孵育15分钟。然后，将 20 微升所得裂解物加入含有 100 微升萤火虫荧光素酶底物试剂的新 96 孔测定板中，并通过敲击轻轻混合板。将板加载到读板器上，并使用读数高度为1毫米，积分时间为1秒的顶部检测器测量发光。

读取萤火虫荧光素酶发光后，立即向孔中加入 100 微升雷尼拉萤光素酶底物，在评估雷尼拉萤光素酶活性的同时淬灭萤火虫萤光素酶活性。通过轻轻的板搅拌混合样品并再次测量发光以评估Renilla荧光素酶活性。通过量化报告者反应并将每个变异体的萤火虫和雷尼拉值与野生型 Ube3a 标准化来比较变异蛋白的相对活性。

用越来越多的编码野生型Ube3a的质粒转染的HEK293T细胞显示BAR反应的线性增加。BAR测定可识别质粒的疾病相关变异，证明了该方法的准确性和通用性。152 个 Ube3a 变体的 BAR 测定筛选显示相对于野生型 Ube3a 的良性功能丧失和功能突变增益。

Ube3a位置的功能谷氨酸取代、功能脯氨酸替代丧失和另一个功能精氨酸替代丧失产生了截然不同的效果，从而强调了经验变异评估的重要性。热图显示了归一化 BAR 结果，用于在 Ube3a 中位置 588 进行全面的突变分析。白色阴影表示野生型Ube3a活性水平，蓝色阴影表示功能丧失，红色阴影表示功能突变的获得。

除了我们工作的临床意义之外，Ube3a还是泛素连接酶HECT结构域家族的成员，这些家族都具有保守的HECT催化结构域。我认为我们工作的一个有趣的方面是它提供了关于Ube3a的丰富结构函数数据，这可以用来获得对这类酶的更深入的机理理解。