Yöntemimiz, Angelman sendromuna neden olan ve Dup15q sendromu olarak bilinen genetik bir otizm formuyla güçlü bir şekilde bağlantılı olan ubikitin ligaz olan Ube3a'daki varyantların fonksiyonel etkisini anlamak için hızlı bir yol sağlar. Ubikitin ligaz aktivitesinin karakterizasyonu geleneksel olarak emek yoğun ve yavaştır ve bu tür yöntemler zordur ve Ube3a için tanımlanan yüzlerce varyantı karakterize etmek için gerçekten uygun değildir. Angelman sendromu, maternal Ube3a geninin silinmesinden kaynaklanırken, Dup15q sendromu maternal Ube3a'nın çoğaltılmasından kaynaklanır, bu nedenle yanlış değişken varyantların Ube3a enziminin aktivitesini nasıl değiştirdiğini çıkarmak önemlidir ve bu, her varyantı ampirik olarak test etmeden yapılması zor bir şeydir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımda bir araştırma teknisyeni olan Jalin Stelzer olacak. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında 37 santigrat derecede yetiştirilen HEK293T hücrelerinde, makalede açıklandığı gibi, nemlendirilmiş bir kapta% 5 karbondioksit ile tahlilleri yaparak başlayın. Bir biyogüvenlik kabininde, askıya alınmış HEK293T hücrelerini doku kültürü ile işlenmiş 96 iyi düz tabanlı bir plakaya yerleştirin ve hücreleri gece boyunca 37 derecede inkübe edin.
İkinci gün, bir biyogüvenlik kabinindeki hücreleri Firefly ve Renilla lusiferaz muhabir plazmidleri ve üçlü olarak Ube3a plazmidleri ile transfekte edin. Transfeksiyonları kuyu başına toplam 10 mikrolitre hacimde gerçekleştirin. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde her varyant için transfeksiyonlar için bir ana karışım oluşturun ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, tüpe dokunarak transfeksiyon karışımını hafifçe çalkalayın ve ardından transfeksiyon karışımının 10 mikrolitresini doğrudan kuyucuklardaki mevcut büyüme ortamına ekleyin. Daha sonra, hücreleri inkübatöre geri döndürün ve plazmidlerin 48 saat boyunca eksprese etmesine izin verin. Bir floresan mikroskobu kullanarak, GFP floresan ile transfeksiyon verimliliğini izleyin.
Hücrelerin% 80'inden fazlası 48 saat sonra GFP'yi eksprese etmelidir. Kültür ortamını transfekte HEK293T hücrelerinden dikkatlice aspire edin ve ardından hücreleri soğuk PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin.
Hücre lizisi için 25 mikrolitre denatüre olmayan lizis tamponu ekleyin ve hafifçe sallanarak buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, elde edilen lizatın 20 mikrolitresini, 100 mikrolitre Firefly lusiferaz substrat reaktifi içeren yeni bir 96 kuyucuklu tahlil plakasına ekleyin ve plakayı hafifçe dokunarak karıştırın. Plakayı bir plaka okuyucuya yükleyin ve bir milimetre okuma yüksekliğine ve bir saniyelik entegrasyon süresine sahip bir üst dedektör kullanarak parlaklığı ölçün.
Firefly lusiferaz lüminesansını okuduktan hemen sonra, kuyucuklara 100 mikrolitre Renilla lusiferaz substratı ekleyin, bu da Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirirken Firefly lusiferaz aktivitesini söndürür. Numuneleri nazik plaka ajitasyonu ile karıştırın ve Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için lüminesansı tekrar ölçün. Muhabir yanıtlarını ölçerek ve her varyant için Firefly ve Renilla değerini vahşi tip Ube3a'ya karşı normalleştirerek varyant proteinlerinin göreceli aktivitesini karşılaştırın.
Artan miktarlarda plazmid kodlaması ile transfekte edilen HEK293T hücreleri, vahşi tip Ube3a, BAR yanıtında doğrusal bir artış göstermektedir. BAR testi, plazmidlerin hastalığa bağlı varyantlarını tanımlar ve bu yöntemin doğruluğunu ve genelliğini gösterir. 152 Ube3a varyantı için BAR tahlil ekranı, vahşi tip Ube3a'ya göre iyi huylu fonksiyon kaybını ve fonksiyon mutasyonlarının kazanımını gösterir.
Fonksiyon glutamat ikamesinin kazanılması, fonksiyon kaybı prolin ikamesi ve Ube3a'nın 588 pozisyonundaki başka bir fonksiyon arginin ikamesi kaybı, büyük ölçüde farklı etkiler üretmiş ve böylece ampirik varyant değerlendirmesinin önemini vurgulamıştır. Isı grafiği, Ube3a'da 588 konumunda kapsamlı mutasyon analizi için normalleştirilmiş BAR sonuçlarını göstermektedir. Beyaz gölgelendirme vahşi tip Ube3a aktivite seviyelerini, mavi gölgelendirme fonksiyon kaybını ve kırmızı gölgelendirme fonksiyon mutasyonlarının kazanımını gösterir.
Çalışmamızın klinik sonuçlarının ötesinde, Ube3a, hepsi korunmuş HECT katalitik alana sahip olan ubikitin ligazlarının HECT alan ailesinin bir üyesidir. Ve bence çalışmamızın büyüleyici yönlerinden biri, Ube3a hakkında zengin yapı fonksiyonu verileri sağlaması ve bu, bu enzim sınıfı için daha derin bir mekanik anlayış kazanmak için kullanılabilir.
