私たちの方法は、アンジェルマン症候群を引き起こし、Dup15q症候群として知られる自閉症の遺伝的形態と強く関連しているユビキチンリガーゼであるUbe3aの変異体の機能的影響を理解するための迅速な方法を提供します。ユビキチンリガーゼ活性の特性評価は伝統的に労働集約的で遅く、そのような方法は困難であり、Ube3aについて同定された何百もの変異体を特徴付けるのに実際には適していません。アンジェルマン症候群は母体のUbe3a遺伝子の欠失によって引き起こされますが、Dup15q症候群は母体のUbe3aの複製によって引き起こされるため、ミスセンスバリアントがUbe3a酵素の活性をどのように変化させたかを推測することが重要であり、これは各バリアントを経験的にテストせずに行うことは困難です。
手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるジャリン・ステルツァーです。原稿に記載されているように、ダルベッコの改変イーグル培地で摂氏37度で増殖したHEK293T細胞で、加湿容器に5%の二酸化炭素を入れてアッセイを実行することから始めます。バイオセーフティキャビネットで、吊り下げたHEK293T細胞を組織培養処理した96ウェル平底プレートにプレートし、細胞を37度で一晩インキュベートします。
2日目に、バイオセーフティキャビネット内の細胞にホタルとシノイの木のルシフェラーゼレポータープラスミド、およびUbe3aプラスミドをトリプリケートでトランスフェクトします。トランスフェクションは、ウェルあたり総容量10マイクロリットルで行います。各バリアントのトランスフェクションのマスターミックスを1.5ミリリットルの微量遠心チューブで作成し、室温で15分間インキュベートします。
インキュベーション後、チューブを軽くたたいてトランスフェクション混合物を穏やかに撹拌し、10マイクロリットルのトランスフェクション混合物をウェル内の既存の増殖培地に直接加えます。その後、細胞をインキュベーターに戻し、プラスミドを48時間発現させます。蛍光顕微鏡を用いて、GFP蛍光によるトランスフェクション効率をモニターする。
細胞の80%以上が48時間後にGFPを発現するはずです。トランスフェクトされたHEK293T細胞から培養液を注意深く吸引し、次に細胞を冷たいPBSで洗浄します。PBSを吸引します。
細胞溶解用に25マイクロリットルの非変性溶解バッファーを加え、穏やかに揺らしながら氷上で15分間インキュベートします。次に、得られたライセート20マイクロリットルを、100マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質試薬を含む新しい96ウェルアッセイプレートに加え、タップしてプレートを穏やかに混合します。プレートをプレートリーダーにロードし、読み取り高さ1ミリメートル、積分時間1秒のトップ検出器を使用して発光を測定します。
ホタルルシフェラーゼ発光を読んだ直後に、100マイクロリットルのレニヤルシフェラーゼ基質をウェルに加え、ホタルルシフェラーゼ活性を消光させ、シタケルシフェラーゼ活性を評価します。穏やかなプレート攪拌によってサンプルを混合し、発光を再度測定して、Renillaルシフェラーゼ活性を評価します。レポーター応答を定量化し、野生型Ube3aに対する各変異体のホタル値とレニラ値を正規化することにより、変異体タンパク質の相対活性を比較します。
野生型Ube3aをコードするプラスミドの量を増やしてトランスフェクトしたHEK293T細胞は、BAR応答の直線的な増加を示しています。BARアッセイは、プラスミドの疾患関連変異体を同定し、この方法の精度と一般性を実証します。152のUbe3a変異体のBARアッセイスクリーニングは、野生型Ube3aと比較して良性の機能喪失および機能獲得変異を示しています。
Ube3aの588位での機能グルタミン酸置換の獲得、機能プロリン置換の喪失、および別の機能アルギニン置換の喪失は、劇的に異なる効果をもたらし、それによって経験的バリアント評価の重要性を強調しました。ヒートプロットは、Ube3aの位置588での包括的な突然変異分析のための正規化されたBAR結果を示しています。白い網掛けは野生型のUbe3a活性レベルを表し、青い網掛けは機能の喪失を示し、赤い網掛けは機能変異の獲得を示します。
私たちの研究の臨床的意味を超えて、Ube3aはユビキチンリガーゼのHECTドメインファミリーのメンバーであり、それらはすべて保存されたHECT触媒ドメインを持っています。そして、私たちの研究の魅力的な側面の1つは、Ube3aに関する豊富な構造関数データを提供することであり、これを使用して、このクラスの酵素のより深いメカニズムの理解を得ることができます。
