Наш метод обеспечивает быстрый способ понять функциональное воздействие вариантов в Ube3a, убиквитин-лигазе, которая вызывает синдром Ангельмана и тесно связана с генетической формой аутизма, известной как синдром Dup15q. Характеристика активности убиквитин-лигазы традиционно трудоемка и медленна, и такие методы сложны и не поддаются характеристике сотен вариантов, идентифицированных для Ube3a. Синдром Ангельмана вызван делецией материнского гена Ube3a, тогда как синдром Dup15q вызван дупликацией материнского Ube3a, поэтому важно определить, как ошибочные варианты изменили активность фермента Ube3a, и это то, что трудно сделать без эмпирической проверки каждого варианта.
Продемонстрировать процедуру будет Джалин Штельцер, техник-исследователь в моей лаборатории. Начните с выполнения анализов в клетках HEK293T, выращенных в модифицированной орлиной среде Dulbecco при 37 градусах Цельсия, с 5% углекислого газа в увлажненном контейнере, как описано в рукописи. В шкафу биобезопасности нанесите взвешенные клетки HEK293T на обработанную культурой ткани 96 хорошо плоскодонную пластину и инкубируйте клетки в течение ночи при 37 градусах.
На второй день трансфектируют клетки в шкафу биобезопасности с помощью репортерных плазмид Firefly и Renilla luciferase и плазмид Ube3a в трех экземплярах. Выполняют трансфекции в общем объеме 10 микролитров на лунку. Создайте мастер-микс для трансфекции для каждого варианта в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
После инкубации осторожно перемешайте трансфекционную смесь, постукивая по трубке, а затем добавьте 10 микролитров трансфекционной смеси непосредственно к существующей питательной среде в скважинах. После этого верните клетки в инкубатор и дайте плазмидам экспрессироваться в течение 48 часов. Используя флуоресцентный микроскоп, контролируйте эффективность трансфекции флуоресценцией GFP.
Более 80% клеток должны экспрессировать GFP через 48 часов. Тщательно аспирируйте культуральную среду из трансфектированных клеток HEK293T, а затем промывайте клетки холодным PBS. Аспирировать PBS.
Добавьте 25 микролитров неденатурирующего лизисного буфера для лизиса клеток и инкубируйте в течение 15 минут на льду с мягким раскачиванием. Затем добавьте 20 микролитров полученного лизата в новую 96-луночную пробирную пластину, содержащую 100 микролитров реагента субстрата люциферазы Светлячка, и аккуратно перемешайте пластину постукиванием. Загрузите пластину на считыватель пластин и измерьте люминесценцию с помощью верхнего детектора с высотой считывания один миллиметр и временем интеграции в одну секунду.
Сразу после считывания люминесценции люциферазы светлячка добавьте в лунки 100 микролитров субстрата люциферазы Renilla, который гасит активность люциферазы Firefly при оценке активности люциферазы Renilla. Смешайте образцы мягким перемешиванием пластин и снова измерьте люминесценцию, чтобы оценить активность люциферазы Renilla. Сравните относительную активность вариантных белков путем количественной оценки репортерных ответов и нормализации значения Firefly и Renilla для каждого варианта по сравнению с диким типом Ube3a.
Клетки HEK293T, трансфектированные растущим количеством плазмиды, кодирующей Ube3a дикого типа, показывают линейное увеличение ответа BAR. Анализ BAR идентифицирует связанные с заболеванием варианты плазмид, демонстрируя точность и общность этого метода. Экран анализа BAR для 152 вариантов Ube3a показывает доброкачественную потерю функции и усиление мутаций функции относительно Ube3a дикого типа.
Усиление замещения функции глутамата, потеря функции пролинового замещения и еще одна потеря функции замещения аргинина в позиции 588 Ube3a произвели совершенно разные эффекты, тем самым подчеркнув важность эмпирической оценки вариантов. Тепловой график показывает нормализованные результаты BAR для всестороннего мутационного анализа в позиции 588 в Ube3a. Белое затенение представляет уровни активности Ube3a дикого типа, синее затенение указывает на потерю функции, а красное затенение указывает на усиление мутаций функции.
Помимо клинических последствий нашей работы, Ube3a является членом семейства доменов HECT убиквитиновых лигазов, которые все обладают сохраненным каталитическим доменом HECT. И я думаю, что одним из увлекательных аспектов нашей работы является то, что она предоставляет богатые данные о структурных функциях Ube3a, и это может быть использовано для получения более глубокого механистического понимания этого класса ферментов.
