우리의 방법은 Angelman 증후군을 유발하고 Dup15q 증후군으로 알려진 유전 적 형태의 자폐증과 밀접한 관련이있는 유비퀴틴 리가 아제 인 Ube3a의 변이체의 기능적 영향을 이해하는 빠른 방법을 제공합니다. 유비퀴틴 리가제 활성의 특성화는 전통적으로 노동 집약적이고 느리며, 이러한 방법은 Ube3a에 대해 확인된 수백 가지 변이체를 특성화하는 것이 어렵고 실제로 적합하지 않습니다. 엔젤만 증후군은 모계 Ube3a 유전자의 결실로 인해 발생하는 반면, Dup15q 증후군은 모계 Ube3a의 복제로 인해 발생하므로 잘못된 변이가 Ube3a 효소의 활성을 어떻게 변화시켰는지 추론하는 것이 중요하며, 이는 각 변이체를 경험적으로 테스트하지 않고는 하기 어려운 일입니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Jalin Stelzer가 될 것입니다. 원고에 설명 된대로 가습 용기에 5 % 이산화탄소를 사용하여 섭씨 37 도의 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지에서 성장한 HEK293T 세포에서 분석을 수행하여 시작하십시오. 생물안전 캐비닛에서 부유된 HEK293T 세포를 조직 배양 처리된 96웰 평평한 바닥 플레이트에 플레이트하고 세포를 37도에서 밤새 배양합니다.
둘째 날에, 세포를 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라아제 리포터 플라스미드, 및 Ube3a 플라스미드를 삼중으로 생물안전 캐비닛에서 형질감염시킨다. 웰 당 10 마이크로 리터의 총 부피로 형질 감염을 수행하십시오. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 각 변이체에 대한 형질주입을 위한 마스터 믹스를 만들고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 튜브를 두드려 형질주입 혼합물을 부드럽게 교반한 다음, 10 마이크로리터의 형질주입 혼합물을 웰 내의 기존 성장 배지에 직접 첨가한다. 그 후, 세포를 인큐베이터로 되돌리고 플라스미드가 48시간 동안 발현되도록 합니다. 형광 현미경을 사용하여, GFP 형광에 의한 형질감염 효율을 모니터링한다.
80% 이상의 세포가 48시간 후에 GFP를 발현해야 합니다. 형질감염된 HEK293T 세포로부터 배양 배지를 조심스럽게 흡인하고, 차가운 PBS로 세포를 세척한다. PBS를 흡인합니다.
세포 용해를 위해 25마이크로리터의 비변성 용해 완충액을 추가하고 부드러운 흔들림으로 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 이어서, 생성된 용해물 20 마이크로리터를 반딧불이 루시퍼라제 기질 시약 100 마이크로리터를 함유하는 새로운 96-웰 분석 플레이트에 첨가하고, 두드려서 플레이트를 부드럽게 혼합한다. 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 판독 높이가 1mm이고 적분 시간이 1초인 상단 검출기를 사용하여 발광을 측정합니다.
반딧불이 루시퍼라아제 발광을 읽은 직후, 100마이크로리터의 레닐라 루시퍼라아제 기질을 웰에 첨가하여 레닐라 루시퍼라아제 활성을 평가하면서 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 소멸시킨다. 샘플을 부드러운 플레이트 교반에 의해 혼합하고 발광을 다시 측정하여 레닐라 루시퍼라아제 활성을 평가하였다. 리포터 반응을 정량화하고 각 변이체에 대한 Firefly 및 Renilla 값을 야생형 Ube3a에 대해 정규화하여 변이체 단백질의 상대적 활성을 비교합니다.
야생형 Ube3a를 코딩하는 플라스미드의 증가량으로 형질감염된 HEK293T 세포는 BAR 반응의 선형 증가를 나타낸다. BAR 분석은 플라스미드의 질병 관련 변이체를 식별하여 이 방법의 정확성과 일반성을 입증합니다. 152개의 Ube3a 변이체에 대한 BAR 분석법은 야생형 Ube3a에 비해 양성 기능 손실 및 기능 돌연변이 획득을 나타낸다.
Ube3a의 위치 588에서 기능 글루타메이트 치환의 이득, 기능 프롤린 치환의 상실 및 기능 아르기닌 치환의 또 다른 손실은 크게 다른 효과를 생성함으로써 경험적 변이 평가의 중요성을 강조합니다. 히트 플롯은 Ube3a의 위치 588에서 포괄적인 돌연변이 분석을 위한 정규화된 BAR 결과를 보여줍니다. 흰색 음영은 야생형 Ube3a 활동 수준을 나타내고, 파란색 음영은 기능 손실을 나타내며, 빨간색 음영은 기능 돌연변이의 이득을 나타냅니다.
우리 연구의 임상적 의미 외에도 Ube3a는 모두 보존된 HECT 촉매 도메인을 소유하는 유비퀴틴 리가아제의 HECT 도메인 계열의 구성원입니다. 그리고 우리 연구의 흥미로운 측면 중 하나는 Ube3a에 대한 풍부한 구조 함수 데이터를 제공하고 이것이 이 종류의 효소에 대한 더 깊은 기계론적 이해를 얻는 데 사용될 수 있다는 것입니다.
