Nuestro método proporciona una forma rápida de comprender el impacto funcional de las variantes en Ube3a, una ubiquitina ligasa que causa el síndrome de Angelman y está fuertemente relacionada con una forma genética de autismo conocida como síndrome Dup15q. La caracterización de la actividad de la ubiquitina ligasa es tradicionalmente laboriosa y lenta, y tales métodos son difíciles y no son realmente susceptibles de caracterizar los cientos de variantes identificadas para Ube3a. El síndrome de Angelman es causado por la deleción del gen materno Ube3a, mientras que el síndrome Dup15q es causado por la duplicación del Ube3a materno, por lo que es importante deducir cómo las variantes sin sentido cambiaron la actividad de la enzima Ube3a, y esto es algo que es difícil de hacer sin probar empíricamente cada variante.
Demostrando el procedimiento estará Jalin Stelzer, un técnico de investigación en mi laboratorio. Comience realizando los ensayos en células HEK293T, cultivadas en el Medio Águila Modificada de Dulbecco a 37 grados centígrados, con 5% de dióxido de carbono en un recipiente humidificado, como se describe en el manuscrito. En un gabinete de bioseguridad, coloque las células HEK293T suspendidas en una placa de fondo plano 96 bien tratada con cultivo de tejidos e incube las células durante la noche a 37 grados.
El segundo día, transfecte las células en un gabinete de bioseguridad con plásmidos reporteros Firefly y Renilla luciferasa, y plásmidos Ube3a por triplicado. Realizar las transfecciones en un volumen total de 10 microlitros por pocillo. Cree una mezcla maestra para las transfecciones para cada variante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Después de la incubación, agite suavemente la mezcla de transfección golpeando el tubo y luego, agregue 10 microlitros de la mezcla de transfección directamente a los medios de cultivo existentes en los pocillos. Luego, devuelva las células a la incubadora y permita que los plásmidos se expresen durante 48 horas. Usando un microscopio de fluorescencia, monitoree la eficiencia de transfección por fluorescencia GFP.
Más del 80% de las células deben expresar GFP después de 48 horas. Aspire cuidadosamente los medios de cultivo de las células HEK293T transfectadas y luego lave las células con PBS frío. Aspirar el PBS.
Agregue 25 microlitros de tampón de lisis no desnaturalizante para la lisis celular e incube durante 15 minutos en hielo con un balanceo suave. Luego, agregue 20 microlitros del lisado resultante en una nueva placa de ensayo de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de un reactivo de sustrato de luciferasa Firefly, y mezcle la placa suavemente golpeando. Cargue la placa en un lector de placas y mida la luminiscencia utilizando un detector superior con una altura de lectura de un milímetro y un tiempo de integración de un segundo.
Inmediatamente después de leer la luminiscencia de la luciferasa Firefly, agregue 100 microlitros de sustrato de la luciferasa de Renilla a los pocillos, lo que apaga la actividad de la luciferasa Firefly mientras evalúa la actividad de la luciferasa de Renilla. Mezclar las muestras agitando suavemente la placa y medir la luminiscencia de nuevo para evaluar la actividad de la Renilla luciferasa. Compare la actividad relativa de las proteínas variantes cuantificando las respuestas del reportero y normalizando el valor de Firefly y Renilla para cada variante contra el tipo salvaje Ube3a.
Las células HEK293T transfectadas con cantidades crecientes de plásmidos que codifican Ube3a de tipo salvaje muestran un aumento lineal en la respuesta BAR. El ensayo BAR identifica variantes de los plásmidos relacionadas con la enfermedad, lo que demuestra la precisión y generalidad de este método. El cribado de ensayo BAR para 152 variantes de Ube3a muestra una pérdida benigna de la función y mutaciones de ganancia de función en relación con Ube3a de tipo salvaje.
La ganancia de la función de sustitución de glutamato, la pérdida de la función de sustitución de prolina y otra pérdida de función de sustitución de arginina en la posición 588 de Ube3a produjeron efectos drásticamente diferentes, lo que subraya la importancia de la evaluación empírica de variantes. El gráfico de calor muestra resultados BAR normalizados para un análisis mutacional exhaustivo en la posición 588 en Ube3a. El sombreado blanco representa los niveles de actividad Ube3a de tipo salvaje, el sombreado azul indica pérdida de función y el sombreado rojo indica mutaciones de ganancia de función.
Más allá de las implicaciones clínicas de nuestro trabajo, Ube3a es miembro de la familia de ligasas de ubiquitina del dominio HECT, que poseen el dominio catalítico HECT conservado. Y creo que uno de los aspectos fascinantes de nuestro trabajo es que proporciona datos ricos en funciones de estructura sobre Ube3a, y esto se puede utilizar para obtener una comprensión mecanicista más profunda de esta clase de enzimas.
