Этот метод может помочь в изучении раннего развития мозжечка человека и того, как оно может быть изменено при нервно-психических расстройствах. Ключевым преимуществом этого метода является генерация ранних мозжечковых клеток человека в структуре 2D-слоя без выполнения сложных шагов. Это также экономически выгодно.
Изготовление вытягивающих пипеток может быть сложным в начале, но с практикой и временем становится легче тянуть пипетки таким образом, чтобы с ними было легче работать. Начните экспериментальную подготовку, вытащив 22,9-сантиметровую пипетку Пастера примерно на два сантиметра ниже шеи, над горелкой Бунзена, чтобы создать две стеклянные пипетки. Более тонкая сторона будет примерно на четыре сантиметра короче другой.
Согните кончики вытянутой стороны на пламени, чтобы создать гладкий R, затем поместите вытянутые пипетки в рукава автоклава и стерилизуйте их в автоклаве. На нулевой день добавьте один миллилитр мозжечковой дифференцировочной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632 и SB-431542, в каждую лунку шестилуночной сверхнизкой пластины крепления или ULA, и поместите ее в инкубатор до тех пор, пока поднятые колонии не будут готовы к добавлению в лунки. Очистите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки.
Аспирируйте среду и добавляйте один миллиметр раствора iPSC для каждого 35-миллиметрового блюда. После трех минут инкубации при 37 градусах Цельсия аспирировать среду и добавить два миллиметра мозжечковой дифференцированной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632 и SB-431542 Под 4-кратным увеличением перевернутого микроскопа пропускаемого света, поднимите колонии с помощью изогнутого края вытянутой стеклянной пипетки. Как только каждая колония будет поднята, аккуратно переложите все колонии в один колодец шестилуночной пластины ULA, используя серологическую пипетку объемом 10 миллилитров.
Повторите этот процесс для каждой пластины iPSC и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. На второй день добавьте FGF2 в каждую скважину, чтобы отрегулировать конечную концентрацию 50 нанограммов на миллилитр. На седьмой день измените одну треть среды, аспирировав один миллилитр отработанной среды и заменив его одним миллилитром свежей мозжечковой дифференцировочной среды.
Насиживайте эмбриоидные тела в течение семи дней. На 14-й день закрутите пластину, чтобы собрать все эмбриоидные тела в центре пластины. Затем наклоните пластину и аспирируйте всю отработанную среду с помощью пипетки 1000 микролитров от края.
По мере уменьшения среднего количества медленно укладывайте пластину плоско и продолжайте аспирировать, оставляя достаточно среды, чтобы избежать вытягивания эмбриоидных тел. Далее добавляют три миллилитра свежей мозжечковой дифференцировочной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632. Затем перенесите эмбриоидные тела с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров в блюдо, покрытое поли-L-орнитином.
На 15 день аспирируйте среду и замените ее свежей мозжечковой дифференцировочной средой. На нулевой день колонии iPSC очищали и поднимали в мозжечковую дифференцирующую среду, содержащую SB-431542 и Y-27632, и помещали в сверхнизкие пластины прикрепления для генерации эмбриональных тел. Добавление FGF2 на второй день и изменение среды на 1/3 на седьмой день привело к увеличению эмбриональных тел на 14-й день.
Клетки начали мигрировать наружу из эмбриональных тел вдоль покрытой поверхности на 15-й день. Полное изменение среды на среду созревания мозжечка с 21-го дня привело к монослою клеток с нейроноподобной морфологией и сложностью к 35-му дню. Анализ экспрессии генов на 35-й день показал, что клетки экспрессируют ранние маркеры-предшественники мозжечка, такие как глутаматергические предшественники, ATOH1, ГАМКергические предшественники, PTF1 альфа и клеточные маркеры-предшественники Пуркинье KIRREL2 и SKOR2.
Кроме того, также наблюдалась экспрессия ромбического губного маркера OTX2 и в основном переднего нейрон-специфического SIX3. Иммунофлуоресцентная маркировка клеток, собранных на 35-й день, показала положительное окрашивание для маркеров мозжечка EN2 и PTF1 альфа, нейронального маркера бета-тубулина III и маркера пролиферации KI67. Ядерное окрашивание 4'6-диамидино-2-фенилиндолом, или DAPI, показало клеточные ядра.
Для успешной дифференциации крайне важно начать со здоровых и недифференцированных колоний iPSC и использовать реагенты, которые как можно только что восстановлены.
