פרוטוקול זה מתאר את היצירה של שומן תרמוגני תלת-ממדי ופונקציונלי ממקטעים מיקרו-וסקולריים, או MVFs. האסטרטגיות הנוכחיות להנדסת רקמת שומן תרמוגנית הן מורכבות ואינן מתארות במלואן את תכונותיה הרב-תאיות והתפקודיות. MVFs הם מקור יחיד של תאים המאפשרים וסקולריזציה ויצירת רקמת שומן.
בהיותה שיטה פשוטה ליצירת חיקויים ביולוגיים של שומן בז', MVFs טומנים בחובם פוטנציאל משמעותי לקידום הבנה או פיתוח של טיפולים להשמנת יתר ומחלות מטבוליות. הניחו את בעל החיים המגולח והמורדם כראוי שטופל באתנול 70% במצב שכיבה והתחילו לבודד את השומן המפשעה. הרימו את העור מתחת לפין בעזרת זוג מספריים ובצעו את החתך, החל במרכז וחיתוך לרוחב, תוך יצירת צורת V, לפני הלולאה לישבן החיה כדי לגשת לכל מאגר השומן.
בזמן החיתוך, הקפידו על הפרדת העור מהשומן על ידי חיתוך רקמת הפאשיה המחוברת. ברגע שהפאשיה נחתכת כראוי, יש לוודא שהשומן המפשעתי משני הצדדים, המשתרע מהמפשעה לכיוון הגב, גלוי. לאחר מכן, הסר את השומן משני הצדדים בצינורות חרוטיים נפרדים המכילים 10 מיליליטר של BSA ב- PBS, בעל ריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר.
כדי לקצור את השומן האפידידימלי, לחתוך דרך עור הבטן, ואחריו לחתוך בזהירות דרך השכבה הדקה המקיפה את האשכים. משכו בעדינות את רקמת השומן באמצעות מלקחיים וגזרו אותה באמצעות מספריים, תוך הימנעות מדיסקציה של כלי דם גדולים הנראים לעין. כעת, הניחו את השומן שהוסר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב- PBS.
כדי לבודד את השומן התת עורי האחורי, הפכו את החולדה לנוטה והשתמשו במספריים גדולים כדי לחתוך את העור העבה של הגב עד הקרקפת, תוך הקפדה לא לחתוך עמוק מדי מתחת לעור. חותכים את הפאשיה המחברת את העור לרקמה. להבדיל את השומן התת עורי, הממוקם באזור intrascapular, מן השומן החום הממוקם קרוב יותר לעמוד השדרה לפני בידוד והנחת השומן תת עורי בצינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב PBS.
תוך כדי עבודה בתוך ביוהוד, השתמשו במלקחיים כדי להכניס את השומן שנכרת לצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מיליליטר המכילה 0.5 מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב-PBS. הסר כל כלי דם גלויים, שרירים או רקמה חיצונית מן השומן. בעזרת מספריים, לטחון את השומן במשך 10 דקות ולבדוק גושים על ידי הוספת עוד קצת BSA.
ממשיכים לטחון, במידת הצורך, לפני העברת תרחיף השומן הטחון לבקבוק סטרילי של 250 מיליליטר עם פיפטה של 10 מיליליטר. הפוך את נפח הבקבוק עד 20 מיליליטר על ידי הוספת מספיק BSA PBS. כעת הוסיפו BSA ב-PBS לקולגנאז, והפכו את התמיסה להומוגנית על ידי ניעור עדין לפני שתסננו אותה סטרילית דרך מסנן ניילון נטו של 0.22 מיקרון.
מיד להוסיף את הכמות הנדרשת של תמיסת collagenase לתרחיף שומן טחון, ולעכל את השומן על ידי ניעור הבקבוק בתנועה סיבובית באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים. מעבירים את השומן המעוכל לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המסומן כשומן מעוכל או שומן טחון. צנטריפוגה את הצינור ב 400 G במשך ארבע דקות כדי לסובב את שברי כלי הדם, או MVFs, לתוך גלולה אדומה.
מרוקנים בעדינות את הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המסומן כפסולת מבלי להפריע לכדורית. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב- PBS לצינור המכיל את הכדור, וערבב את מתלה הגלולה על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה פעמיים מבלי להפריע לשברים. כעת, קחו את המסך בגודל 500 מיקרון שהושרה מראש בצלחת פטרי סטרילית המכילה חמישה מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב-PBS והניחו אותו מעל מחזיק מסך הפלסטיק שנשמר על צלחת פטרי חדשה.
פיפטה 10 מיליליטר של השעיה מצינור הגלולה המעוכל אל המסך במעגלים קונצנטריים. שטפו את הפילטר עם חמישה מיליליטר נוספים של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב-PBS והשליכו אותו, תוך שמירה על התסנין בתוך צלחת הפטרי. לאחר מכן הניחו את המסך הספוג מראש בגודל 37 מיקרון מעל מחזיק מסך הפלסטיק על צלחת פטרי חדשה.
בעזרת פיפטה טרייה, מעבירים את התסנין מהסינון הראשון אל המסך במעגלים קונצנטריים. כפי שתואר קודם לכן, שטפו את המסך עם BSA ב-PBS, והפעם, השליכו את התסנין תוך שמירה על מסך 37 מיקרון. החלק את המסך בגודל 37 מיקרון לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה חמישה מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר BSA ב- PBS.
עקרו את השברים על ידי הקשה עדינה של הכלי על מחזיק חרוט, מבלי לשפוך נוזל. שטוף את המסנן עם חמישה מיליליטר נוספים של BSA ב- PBS. לאחר מכן, להעביר את הנוזל מן צלחת פטרי לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר.
שטפו את המסך בגודל 37 מיקרון מספר פעמים נוספות, והוסיפו את השטיפה לצינור החרוטי עד שהנפח הכולל שנאסף הוא 15 עד 20 מיליליטר. יש להשליך את המסך לאחר השטיפה הסופית. חותכים קצה של קצה פיפטה 20 מיקרוליטר באמצעות מספריים.
נערו בעדינות את הצינור המכיל את הנוזל לפני שתוציאו שני אליציטוטים של 20 מיקרוליטר באמצעות קצה הפיפטה החתוך, ופיפטה כל אחד מהאליציטוטים לצלחת פטרי נקייה בקוטר 35 מ"מ. ספרו את מספר השברים בדגימה בכל צלחת פטרי באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי, ובאמצעות הנוסחה המוזכרת בכתב היד, קבלו את המספר הכולל של שברי כלי דם מבודדים. סובבו את הנוזל שנותר בצינור החרוטי של 50 מיליליטר ב-400 גרם במשך ארבע דקות כדי לאסוף את ה-MVF.
לאחר הסיבוב, מרוקנים את רוב הסופרנאטנט מהצינור החרוטי ומשתמשים בפיפטה כדי להסיר את נפח הנוזל הקטן שנותר על שפת הצינור. לאחר מכן, להוסיף טרומבין לתוך בארות המיועדות יציקת ג'לים. חתכו את קצהו של קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, והשתמשו בו השהה מחדש בעדינות את ה-MVFs בפיברינוגן כדי להשיג את הצפיפות הסופית הרצויה.
פיפטה את התרחיף לתוך תמיסת תרומבין בבאר במהירות הומוגנית את התערובת על ידי pipeting למעלה ולמטה. לאחר יציקת כל הג'לים, הניחו את צלחת הבאר באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך כ-15 דקות כדי לאפשר הצלבת ג'ל. השומנים והאדיפוציטים המובחנים נצפו על ידי הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של ההידרוג'לים באמצעות BODIPY ככתם השומנים.
תרבית של רקמת שומן לא וסקולרית באמצעות מדיה אדיפוגנית לבנה או בז' אדיפוגנית הביאה להיווצרות רקמת שומן לבנה או בז' לא וסקולרית, בהתאמה, הן מ- MVF רזים והן ממכרסמים סוכרתיים. באופן דומה, תרבית של רקמת שומן וסקולרית באמצעות מדיה אדיפוגנית לבנה או בז' אדיפוגנית הביאה להיווצרות רקמת שומן לבנה או בז' וסקולרית, בהתאמה, מ- MVF שמקורם במכרסמים. רקמת שומן לבנה ובז' לא וסקולרית שהושגה מ- MVF אנושיים נצפתה גם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי.
היכולת של MVFs להתמיין לרקמת שומן בצבע בז' אושרה גנטית באמצעות RT-qPCR. MVF של מכרסמים רזים וסוכרתיים שנחשפו למדיה אדיפוגנית לבנה ישירה או בז' הוערכו עבור אדיפוגנזה, תרמוגנזה ואנגיוגנזה. הביטוי של חלבון 1 כצפוי, היה גבוה משמעותית ברקמה אדיפוגנית בצבע בז'.
מגמה דומה נצפתה במכרסמים MVF שנחשפו למדיה אדיפוגנית לבנה או בז' אדיפוגנית עקיפה, כמו גם בMVF אנושיים שנחשפו למדיה אדיפוגנית לבנה ישירה או בז'. לבסוף, מביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית, היה ברור כי מבחינה תפקודית, רקמת השומן בצבע בז' הייתה בעלת קצב צריכת חמצן גבוה יותר, או OCR, בכל המקרים. העיכול האנזימטי של רקמת השומן צריך להיות אופטימלי כדי לשחזר באופן עקבי MVF בגודל ובאיכות דומים.
לאחר העיכול, MVFs צריך להיות מטופל בעדינות, עם תשומת לב מיוחדת כדי למנוע פירוק נוסף של שברים. טכניקה זו סייעה לקדם את האיזון של צמיחת כלי הדם והתמיינות אדיפוציטים, הוכח להיות תלוי בגורמים שהוכנסו.
