Ce protocole décrit la génération de graisse thermogénique tridimensionnelle vascularisée et fonctionnelle à partir de fragments microvasculaires, ou MVF. Les stratégies actuelles d’ingénierie du tissu adipeux thermogénique sont complexes et ne décrivent pas pleinement ses propriétés multicellulaires et fonctionnelles. Les MVF sont une source unique de cellules qui permettent la vascularisation et la formation de tissu adipeux.
Étant une méthode simple à source unique pour créer des imitations biologiques de graisse beige, les MVF ont un potentiel important pour promouvoir la compréhension ou le développement de traitements pour l’obésité et les maladies métaboliques. Placer l’animal convenablement rasé et euthanasié traité avec de l’éthanol à 70 % en décubitus dorsal et commencer l’isolement de la graisse inguinale. Soulevez la peau sous le pénis avec une paire de ciseaux et effectuez l’incision, en commençant par le centre et en coupant latéralement, formant une forme de V, avant de boucler sur le dos de l’animal pour accéder à l’ensemble du dépôt de graisse.
Pendant la coupe, assurez-vous de séparer la peau de la graisse en coupant le tissu fascia interconnecté. Une fois que le fascia est correctement coupé, assurez-vous que la graisse inguinale des deux côtés, s’étendant de l’aine vers l’arrière, est visible. Ensuite, retirez la graisse des deux côtés dans des tubes coniques séparés contenant 10 millilitres de BSA dans du PBS, ayant une concentration d’un milligramme par millilitre.
Pour récolter la graisse épididymaire, coupez à travers la peau abdominale, puis coupez soigneusement à travers la fine couche entourant les testicules. Tirez doucement le tissu adipeux à l’aide d’une pince et découpez-le à l’aide de ciseaux, tout en évitant la dissection des principaux vaisseaux sanguins visibles. Maintenant, placez la graisse retirée dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres d’un milligramme par millilitre BSA dans PBS.
Pour isoler la graisse sous-cutanée postérieure, tournez le rat couché et utilisez de grands ciseaux pour couper la peau épaisse du dos jusqu’au cuir chevelu, en prenant soin de ne pas couper trop profondément sous la peau. Coupez le fascia reliant la peau au tissu. Différencier la graisse sous-cutanée, située dans la région intrascapulaire, de la graisse brune située plus près de la colonne vertébrale avant d’isoler et de placer la graisse sous-cutanée dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans du PBS.
Lorsque vous travaillez à l’intérieur d’un biohood, utilisez des pinces pour placer la graisse excisée dans une boîte de Petri standard de 100 millilitres contenant 0,5 millilitre d’un milligramme par millilitre de BSA dans du PBS. Enlevez tous les vaisseaux sanguins visibles, les muscles ou les tissus étrangers de la graisse. À l’aide de ciseaux, hachez la graisse pendant 10 minutes et vérifiez s’il y a des grumeaux en ajoutant un peu plus de BSA.
Poursuivre le hachage, si nécessaire, avant de transférer la suspension de graisse hachée dans une fiole stérile de 250 millilitres à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Augmenter le volume dans la fiole jusqu’à 20 millilitres en ajoutant suffisamment de BSA dans le PBS. Maintenant, ajoutez du BSA dans du PBS à la collagénase et homogénéisez la solution en la secouant doucement avant de la filtrer stérile à travers un filet en nylon de 0,22 micron.
Ajouter immédiatement la quantité requise de solution de collagénase à la suspension de graisse hachée et digérer la graisse en agitant la fiole dans un mouvement circulaire dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant la durée appropriée. Transférez la graisse digérée dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté graisse digérée ou graisse hachée. Centrifuger le tube à 400 G pendant quatre minutes pour faire tourner les fragments microvasculaires, ou MVF, en une pastille rouge.
Décanter doucement le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté déchets sans déranger le granulé. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans PBS au tube contenant la pastille et mélangez la suspension de granulés en la pipetant doucement de haut en bas deux fois sans perturber les fragments. Maintenant, prenez l’écran de 500 microns pré-trempé dans une boîte de Petri stérile contenant cinq millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans PBS et placez-le sur le support d’écran en plastique conservé sur une nouvelle boîte de Pétri.
Pipeter 10 millilitres de suspension du tube de granulés digérés sur l’écran en cercles concentriques. Lavez le filtre avec cinq millilitres supplémentaires d’un milligramme par millilitre de BSA dans du PBS et jetez-le, tout en conservant le filtrat à l’intérieur de la boîte de Pétri. Placez ensuite l’écran pré-trempé de 37 microns au-dessus du support d’écran en plastique sur une nouvelle boîte de Pétri.
À l’aide d’une pipette fraîche, transférer le filtrat de la première filtration sur l’écran en cercles concentriques. Comme décrit précédemment, lavez l’écran avec BSA dans PBS, et cette fois, jetez le filtrat tout en conservant l’écran de 37 microns. Faites glisser l’écran de 37 microns dans une nouvelle boîte de Petri contenant cinq millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans PBS.
Délogez les fragments en tapotant doucement le plat contre un support conique, sans renverser de liquide. Rincez le filtre avec cinq millilitres supplémentaires de BSA dans PBS. Ensuite, transférez le liquide de la boîte de Petri dans un tube conique stérile de 50 millilitres.
Rincez l’écran de 37 microns plusieurs fois, en ajoutant le lavage au tube conique jusqu’à ce que le volume total recueilli soit de 15 à 20 millilitres. Jetez l’écran après le rinçage final. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 20 microlitres à l’aide de ciseaux.
Secouez doucement le tube contenant le liquide avant d’aspirer deux aliquotes de 20 microlitres à l’aide de l’embout coupé de la pipette et de pipeter chacune des aliquotes dans une boîte de Petri propre de 35 millimètres. Compter le nombre de fragments dans l’échantillon de chaque boîte de Petri à l’aide d’un microscope optique standard et, en utilisant la formule mentionnée dans le manuscrit, obtenir le nombre total de fragments microvasculaires isolés. Faites tourner le liquide restant dans le tube conique de 50 millilitres à 400 g pendant quatre minutes pour recueillir le MVF.
Après l’essorage, décanter la majeure partie du surnageant du tube conique et utiliser une pipette pour enlever le petit volume de liquide restant sur le bord du tube. Ensuite, ajoutez de la thrombine dans les puits désignés pour les gels de coulée. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres et, en l’utilisant, remettez doucement en suspension les MVF dans le fibrinogène pour obtenir la densité finale souhaitée.
Pipeter la suspension dans la solution de thrombine dans le puits et homogénéiser rapidement le mélange en pipetant de haut en bas. Une fois que tous les gels sont coulés, placez la plaque de puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant environ 15 minutes pour permettre la réticulation du gel. Les lipides et les adipocytes différenciés ont été observés par imagerie par microscopie confocale des hydrogels en utilisant BODIPY comme coloration lipidique.
La culture de tissu adipeux non vascularisé à l’aide de milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges a entraîné la formation de tissu adipeux blanc ou beige non vascularisé, respectivement, à partir de MVF maigres et diabétiques dérivés de rongeurs. De même, la culture de tissu adipeux vascularisé à l’aide de milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges a entraîné la formation de tissu adipeux blanc ou beige vascularisé, respectivement, à partir des MVF dérivés de rongeurs. Des tissus adipeux blancs et beiges non vascularisés obtenus à partir de MVF humains ont également été observés par microscopie confocale.
La capacité des MVF à se différencier en tissu adipeux beige a été génétiquement confirmée à l’aide de la RT-qPCR. Les MVF de rongeurs maigres et diabétiques exposés à des milieux adipogènes blancs directs ou adipogènes beiges ont été évalués pour l’adipogenèse, la thermogenèse et l’angiogenèse. L’expression de la protéine de découplage 1, comme prévu, était significativement plus élevée dans le tissu adipogène beige.
Une tendance similaire a été observée chez les MVF de rongeurs exposés à des milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges indirects, ainsi que chez les MVF humains exposés à des milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges directs. Enfin, d’après la bioénergétique mitochondriale, il était évident que fonctionnellement, le tissu adipeux beige avait un taux de consommation d’oxygène (OCR) caractéristique plus élevé dans tous les cas. La digestion enzymatique du tissu adipeux doit être optimisée pour reproduire systématiquement des MVF de taille et de qualité similaires.
Après la digestion, les MVF doivent être manipulés avec douceur, avec un soin particulier pour éviter une nouvelle rupture des fragments. Cette technique a contribué à renforcer l’équilibre entre la croissance des vaisseaux et la différenciation des adipocytes qui s’est avérée dépendante des facteurs introduits.
