يصف هذا البروتوكول توليد الدهون الحرارية الوعائية ثلاثية الأبعاد والوظيفية من شظايا الأوعية الدموية الدقيقة ، أو MVFs. الاستراتيجيات الحالية لهندسة الأنسجة الدهنية الحرارية معقدة ولا تصور خصائصها الوظيفية والمتعددة الخلايا بشكل كامل. MVFs هي مصدر واحد للخلايا التي تمكن من تكوين الأوعية الدموية والأنسجة الدهنية.
كونها طريقة بسيطة وحيدة المصدر لإنشاء تقليد بيولوجي للدهون البيج ، فإن MVFs تحمل إمكانات كبيرة لتعزيز فهم أو تطوير علاجات للسمنة وأمراض التمثيل الغذائي. ضع الحيوان المحلوق والقتل الرحيم المعالج بنسبة 70٪ من الإيثانول في وضع ضعيف وابدأ في عزل الدهون الأربية. ارفع الجلد أسفل القضيب بمقص وقم بإجراء الشق ، بدءا من المركز والقطع بشكل جانبي ، لتشكيل شكل V ، قبل التكرار إلى مؤخرة الحيوان للوصول إلى رواسب الدهون بالكامل.
أثناء القطع ، تأكد من فصل الجلد عن الدهون عن طريق قطع أنسجة اللفافة المترابطة. بمجرد قطع اللفافة بشكل مناسب ، تأكد من أن الدهون الأربية من كلا الجانبين ، الممتدة من الفخذ نحو الخلف ، مرئية. بعد ذلك ، قم بإزالة الدهون من الجانبين في أنابيب مخروطية منفصلة تحتوي على 10 ملليلتر من BSA في PBS ، بتركيز ملليغرام واحد لكل ملليلتر.
لحصاد الدهون البربخية ، قطع من خلال جلد البطن ، تليها قطع بعناية من خلال الطبقة الرقيقة المحيطة الخصيتين. اسحب الأنسجة الدهنية برفق باستخدام الملقط واقطعها باستخدام المقص ، مع تجنب تشريح أي أوعية دموية رئيسية مرئية. الآن ، ضع الدهون التي تمت إزالتها في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في برنامج تلفزيوني.
لعزل الدهون الخلفية تحت الجلد ، اقلب الفئران عرضة واستخدم مقصا كبيرا لقطع الجلد السميك للظهر وصولا إلى فروة الرأس ، مع الحرص على عدم قطع عميق جدا تحت الجلد. قطع اللفافة التي تربط الجلد بالأنسجة. التفريق بين الدهون تحت الجلد ، الموجودة في المنطقة داخل الكتف ، من الدهون البنية الموجودة بالقرب من العمود الفقري قبل عزل ووضع الدهون تحت الجلد في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في برنامج تلفزيوني.
أثناء العمل داخل غطاء حيوي ، استخدم ملقط لوضع الدهون المستأصلة في طبق بتري قياسي سعة 100 ملليلتر يحتوي على 0.5 ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في برنامج تلفزيوني. إزالة أي أوعية دموية مرئية أو عضلات أو أنسجة غريبة من الدهون. باستخدام المقص ، فرم الدهون لمدة 10 دقائق وتحقق من وجود كتل عن طريق إضافة المزيد من BSA.
استمر في الفرم ، إذا لزم الأمر ، قبل نقل معلق الدهون المفرومة إلى قارورة معقمة سعة 250 ملليلتر مع ماصة 10 ملليلتر. اجعل الحجم في القارورة يصل إلى 20 ملليلتر عن طريق إضافة ما يكفي من BSA في PBS. أضف الآن BSA في PBS إلى كولاجيناز ، وقم بتجانس المحلول عن طريق رجه برفق قبل ترشيحه معقم من خلال مرشح صافي نايلون 0.22 ميكرون.
أضف على الفور الكمية المطلوبة من محلول كولاجيناز إلى معلق الدهون المفرومة ، وهضم الدهون عن طريق هز القارورة بحركة دائرية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لفترة زمنية مناسبة. نقل الدهون المهضومة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر المسمى الدهون المهضومة أو الدهون المفرومة. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 جرام لمدة أربع دقائق لتدوير شظايا الأوعية الدموية الدقيقة ، أو MVFs ، إلى حبيبات حمراء.
صب المادة الطافية برفق في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحمل علامة النفايات دون إزعاج الحبيبات. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات ، وامزج تعليق الحبيبات عن طريق سحبه برفق لأعلى ولأسفل مرتين دون تعطيل الشظايا. الآن ، خذ شاشة 500 ميكرون غارقة مسبقا في طبق بتري معقم يحتوي على خمسة ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في PBS وضعه فوق حامل الشاشة البلاستيكي المحفوظ على طبق بتري جديد.
ماصة 10 ملليلتر من التعليق من أنبوب بيليه المهضوم على الشاشة في دوائر متحدة المركز. اغسل الفلتر بخمسة ملليلتر إضافية من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في PBS وتخلص منه ، مع الاحتفاظ بالترشيح داخل طبق بتري. ثم ضع الشاشة المنقوعة مسبقا 37 ميكرون فوق حامل الشاشة البلاستيكي على طبق بتري جديد.
باستخدام ماصة جديدة ، انقل المرشح من الترشيح الأول إلى الشاشة في دوائر متحدة المركز. كما هو موضح سابقا ، اغسل الشاشة باستخدام BSA في PBS ، وهذه المرة ، تخلص من المرشح مع الاحتفاظ بشاشة 37 ميكرون. حرك الشاشة التي يبلغ حجمها 37 ميكرون إلى طبق بتري جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في PBS.
أزاح الشظايا عن طريق النقر برفق على الطبق على حامل مخروطي ، دون انسكاب أي سائل. شطف المرشح مع خمسة ملليلتر إضافية من BSA في PBS. بعد ذلك ، انقل السائل من طبق بتري إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر.
شطف الشاشة 37 ميكرون عدة مرات ، إضافة الغسيل إلى الأنبوب المخروطي حتى الحجم الإجمالي الذي تم جمعه هو 15 إلى 20 ملليلتر. تخلص من الشاشة بعد الشطف النهائي. قطع نهاية طرف ماصة 20 ميكرولتر باستخدام مقص.
هز الأنبوب الذي يحتوي على السائل برفق قبل سحب قسامتين من 20 ميكرولتر باستخدام طرف الماصة المقطوع ، وماصة كل من الحصص في طبق بتري نظيف 35 ملم. احسب عدد الشظايا في العينة في كل طبق بتري باستخدام مجهر ضوئي قياسي ، وباستخدام الصيغة المذكورة في المخطوطة ، احصل على العدد الإجمالي لشظايا الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة. قم بتدوير السائل المتبقي في الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر عند 400 جم لمدة أربع دقائق لجمع MVF.
بعد الدوران ، صب معظم المادة الطافية من الأنبوب المخروطي واستخدم ماصة لإزالة الحجم الصغير من السائل المتبقي على حافة الأنبوب. بعد ذلك ، أضف الثرومبين إلى الآبار المخصصة لصب المواد الهلامية. قم بقص نهاية طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وباستخدامه ، أعد تعليق MVFs برفق في الفيبرينوجين للحصول على الكثافة النهائية المطلوبة.
ماصة التعليق في محلول الثرومبين في البئر وتجانس الخليط بسرعة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. بمجرد صب جميع المواد الهلامية ، ضع صفيحة البئر في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة للسماح بربط الهلام. لوحظت الدهون والخلايا الشحمية المتمايزة عن طريق التصوير المجهري متحد البؤر للهلاميات المائية باستخدام BODIPY كصبغة دهنية.
أدى استزراع الأنسجة الدهنية غير الوعائية باستخدام وسائط دهنية بيضاء أو بيج إلى تكوين أنسجة دهنية بيضاء أو بيج غير وعائية ، على التوالي ، من كل من MVFs المشتقة من القوارض الخالية من الدهون وكذلك القوارض السكرية. وبالمثل ، أدى استزراع الأنسجة الدهنية الوعائية باستخدام وسائط دهنية بيضاء أو بيج إلى تكوين أنسجة دهنية بيضاء أو بيج ، على التوالي ، من MVFs المشتقة من القوارض. كما لوحظت الأنسجة الدهنية البيضاء والبيج غير الوعائية التي تم الحصول عليها من MVFs البشرية بواسطة المجهر متحد البؤر.
تم تأكيد قدرة MVFs على التمايز إلى أنسجة دهنية باللون البيج وراثيا باستخدام RT-qPCR. تم تقييم MVFs الهزيل والقوارض السكري المعرضة لوسائط أديبوجينية بيضاء مباشرة أو بيج المنشأ من أجل تكوين الدهون وتوليد الحرارة وتكوين الأوعية. كان التعبير عن فصل البروتين 1 كما هو متوقع أعلى بكثير في الأنسجة الدهنية البيج.
وقد لوحظ اتجاه مماثل في MVFs القوارض المعرضة لوسائط دهنية بيضاء أو بيضاء غير مباشرة ، وكذلك في MVFs البشرية المعرضة لوسائط adipogenic بيضاء مباشرة أو وسائط adipogenic باللون البيج. أخيرا ، من الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، كان من الواضح أنه من الناحية الوظيفية ، كان للأنسجة الدهنية البيج معدل استهلاك أكسجين أعلى بشكل مميز ، أو OCR ، في جميع الحالات. يجب تحسين الهضم الأنزيمي للأنسجة الدهنية لإعادة إنتاج MVFs ذات الحجم والجودة المماثلة باستمرار.
بعد الهضم ، يجب التعامل مع MVFs بلطف ، مع توخي الحذر بشكل خاص لتجنب المزيد من تفكك الشظايا. ساعدت هذه التقنية على تعزيز توازن نمو الأوعية وتمايز الخلايا الشحمية ، والتي ثبت أنها تعتمد على العوامل التي تم إدخالها.
