このプロトコルは、微小血管断片(MVF)からの三次元血管化および機能性熱発生脂肪の生成について説明しています。 熱発生脂肪組織を操作するための現在の戦略は複雑であり、その多細胞および機能的特性を完全には示していません。MVFは、血管新生と脂肪組織形成を可能にする細胞の単一の供給源です。
MVFは、ベージュ色の脂肪の生物学的模倣を作成するための単純な唯一のソース方法であるため、肥満や代謝性疾患の治療法の理解や開発を促進する大きな可能性を秘めています。70%エタノールで処理した適切に剃毛および安楽死させた動物を仰臥位に置き、鼠径脂肪の分離を開始します。.ハサミで陰茎の下の皮膚を持ち上げ、中央から始めて横方向に切断し、V字型を形成してから、動物の裏側にループして脂肪沈着物全体にアクセスします。
切断中は、相互接続された筋膜組織を切断することにより、脂肪から皮膚を確実に分離します。筋膜が適切に切断されたら、鼠径部から背中に向かって伸びる両側の鼠径脂肪が見えるようにします。次に、1ミリリットルあたり1ミリグラムの濃度のPBSに10ミリリットルのBSAを含む別々の円錐形のチューブで両側から脂肪を取り除きます。
精巣上体脂肪を収穫するには、腹部の皮膚を切り取り、続いて睾丸を囲む薄い層を注意深く切ります。鉗子を使用して脂肪組織をそっと引っ張り、目に見える主要な血管の解剖を避けながら、ハサミを使用して切り取ります。次に、除去した脂肪を、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル含む50ミリリットルの円錐管に入れます。
後部皮下脂肪を分離するには、ラットを伏せて大きなハサミで背中の厚い皮膚を頭皮まで切り、皮膚の下を深く切りすぎないように注意します。皮膚を組織に接続する筋膜を切ります。肩甲骨内領域にある皮下脂肪を脊椎に近い褐色脂肪と区別してから、皮下脂肪を分離して、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル含む50ミリリットルの円錐管に入れます。
バイオフード内で作業している間、鉗子を使用して、切除した脂肪をPBSの1ミリリットルBSAあたり1ミリグラムの0.5ミリリットルを含む標準の100ミリリットルのペトリ皿に入れます。脂肪から目に見える血管、筋肉、または無関係な組織を取り除きます。はさみを使用して、脂肪を10分間ミンチし、さらにBSAを追加してしこりがないか確認します。
必要に応じてミンチを続けてから、ミンチ脂肪懸濁液を10ミリリットルのピペットで滅菌した250ミリリットルのフラスコに移します。PBSに十分なBSAを加えて、フラスコ内の容量を最大20ミリリットルにします。次に、PBS中のBSAをコラゲナーゼに加え、溶液を穏やかに振って均質化してから、0.22ミクロンのナイロンネットフィルターで滅菌ろ過します。
直ちに必要量のコラゲナーゼ溶液を細切脂肪懸濁液に加え、フラスコを摂氏37度の水浴中で円を描くように振って脂肪を消化する。消化された脂肪を、消化脂肪またはミンチ脂肪とラベル付けされた50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを400 Gで4分間遠心分離し、微小血管断片(MVF)を赤いペレットにスピンダウンします。
ペレットを乱すことなく、上清を廃棄物とラベル付けされた50ミリリットルの円錐形のチューブにそっとデカントします。次に、ペレットを入れたチューブにPBS中の1ミリリットル当たり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル加え、断片を乱すことなく2回穏やかに上下にピペッティングしてペレット懸濁液を混合する。次に、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを5ミリリットル含む滅菌ペトリ皿にあらかじめ浸した500ミクロンのスクリーンを取り、新しいペトリ皿に保管されているプラスチック製のスクリーンホルダーの上に置きます。
消化されたペレットチューブから同心円状にスクリーン上に10ミリリットルの懸濁液をピペットで入れる。PBSで1ミリリットルBSAあたり1ミリグラムの追加5ミリリットルでフィルターを洗浄し、ろ液をペトリ皿内に保持しながら廃棄します。次に、事前に浸した37ミクロンのスクリーンを新しいペトリ皿のプラスチックスクリーンホルダーの上に置きます。
新しいピペットを使用して、最初のろ過から同心円でスクリーンにろ液を移します。前述のように、PBSのBSAでスクリーンを洗浄し、今度は37ミクロンのスクリーンを保持したまま濾液を廃棄します。37ミクロンのスクリーンを、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAが5ミリリットル入った新しいペトリ皿にスライドさせます。
液体をこぼさずに、皿を円錐形のホルダーにそっと叩いて破片を取り除きます。PBSでさらに5ミリリットルのBSAでフィルターをすすぎます。次に、ペトリ皿から滅菌50ミリリットルの円錐管に液体を移します。
37ミクロンのスクリーンをさらに数回すすぎ、収集された総量が15〜20ミリリットルになるまでコニカルチューブに洗浄を追加します。最後のすすぎの後、スクリーンを破棄します。ハサミを使用して20マイクロリットルのピペットチップの端を切ります。
カットされたピペットチップを使用して20マイクロリットルの2つのアリコートを引く前に、液体を含むチューブを静かに振って、各アリコートをきれいな35ミリメートルのペトリ皿にピペットで入れます。標準的な光学顕微鏡を用いて各シャーレ中の試料中の断片の数を数え、そして原稿に記載された式を用いて、単離された微小血管断片の総数を得る。50ミリリットルのコニカルチューブ内の残りの液体を400Gで4分間回転させてMVFを収集します。
回転後、円錐管から上清の大部分をデカントし、ピペットを使用して管の縁に残っている少量の液体を除去します。次に、キャストゲル用に指定されたウェルにトロンビンを追加します。200マイクロリットルのピペットチップの端を切り取り、それを使用してMVFをフィブリノーゲンに静かに再懸濁し、目的の最終密度を得ます。
懸濁液をウェル内のトロンビン溶液にピペットで入れ、上下にピペッティングして混合物を素早くホモジナイズします。すべてのゲルをキャストしたら、ウェルプレートを摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに約15分間置き、ゲルの架橋を可能にします。脂質および分化脂肪細胞を、脂質染色剤としてBODIPYを用いたヒドロゲルの共焦点顕微鏡イメージングによって観察した。
白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地を用いて非血管化脂肪組織を培養すると、痩せた齧歯類および糖尿病性のげっ歯類由来のMVFの両方から、それぞれ血管化されていない白色またはベージュの脂肪組織が形成された。同様に、白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地を用いて血管新生脂肪組織を培養すると、げっ歯類由来のMVFからそれぞれ血管化された白色脂肪組織またはベージュ脂肪組織が形成された。 ヒトMVFから得られた非血管化白色およびベージュ脂肪組織も共焦点顕微鏡によって観察された。
MVFのベージュ脂肪組織への分化能は、RT-qPCRを用いて遺伝的に確認された。 直接白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地に曝露された除脂肪および糖尿病のげっ歯類MVFは、脂肪生成、熱発生および血管新生について評価された。予想通りの脱共役タンパク質1の発現は、ベージュ色の脂肪生成組織において有意に高かった。
同様の傾向は、間接的な白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪発生培地に曝露されたげっ歯類MVF、および直接白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪発生培地に曝露されたヒトMVFでも観察されました。.最後に、ミトコンドリアの生体エネルギー学から、機能的には、ベージュ色の脂肪組織はすべてのケースで特徴的に高い酸素消費率(OCR)レベルを持っていることが明らかになりました。脂肪組織の酵素消化は、同様のサイズと品質のMVFを一貫して再現するように最適化する必要があります。
消化後、MVFは、断片がさらに分解しないように特別な注意を払って、穏やかに取り扱う必要があります。この技術は、血管の成長と脂肪細胞の分化のバランスを促進するのに役立ち、導入された要因に依存することが証明されました。
