Этот протокол описывает генерацию трехмерного васкуляризированного и функционального термогенного жира из микрососудистых фрагментов или MVF. Современные стратегии инженерии термогенной жировой ткани сложны и не полностью отражают ее многоклеточные и функциональные свойства. MVF являются единственным источником клеток, которые обеспечивают васкуляризацию и образование жировой ткани.
Будучи простым методом создания биологических имитаций бежевого жира, MVF обладают значительным потенциалом для содействия пониманию или разработке методов лечения ожирения и метаболических заболеваний. Поместите надлежащим образом выбритое и усыпленное животное, обработанное 70% этанолом, в положение лежа на спине и начните изоляцию пахового жира. Поднимите кожу ниже полового члена ножницами и выполните разрез, начиная с центра и разрезая сбоку, образуя V-образную форму, прежде чем перейти к задней части животного, чтобы получить доступ ко всему жировому отложению.
Во время резки обеспечьте отделение кожи от жира, разрезав взаимосвязанную ткань фасции. После того, как фасция будет соответствующим образом разрезана, убедитесь, что паховый жир с обеих сторон, простирающийся от паха к спине, виден. Затем удалите жир с двух сторон в отдельные конические трубки, содержащие 10 миллилитров BSA в PBS, имеющих концентрацию один миллиграмм на миллилитр.
Чтобы собрать жир из придатка яичка, разрежьте кожу живота, а затем осторожно прорежьте тонкий слой, окружающий яички. Аккуратно потяните жировую ткань с помощью щипцов и вырежьте ее ножницами, избегая при этом рассечения каких-либо основных видимых кровеносных сосудов. Теперь поместите удаленный жир в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 10 миллилитров одного миллиграмма на миллилитр BSA в PBS.
Чтобы изолировать заднюю подкожно-жировую клетчатку, переверните крысу на спину и используйте большие ножницы, чтобы разрезать толстую кожу спины до самой головы, стараясь не резать слишком глубоко под кожей. Разрежьте фасцию, соединяющую кожу с тканями. Дифференцируйте подкожный жир, расположенный во внутрилопаточной области, от бурого жира, расположенного ближе к позвоночнику, прежде чем изолировать и поместить подкожный жир в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 10 миллилитров одного миллиграмма на миллилитр BSA в PBS.
Работая внутри биокапюшона, используйте щипцы, чтобы поместить вырезанный жир в стандартную 100-миллилитровую чашку Петри, содержащую 0,5 миллилитра одного миллиграмма на миллилитр BSA в PBS. Удалите из жира любые видимые кровеносные сосуды, мышцы или посторонние ткани. С помощью ножниц измельчите жир в течение 10 минут и проверьте, нет ли комочков, добавив еще немного BSA.
При необходимости продолжайте фарш перед тем, как переложить суспензию измельченного жира в стерильную 250-миллилитровую колбу с помощью 10-миллилитровой пипетки. Увеличьте объем в колбе до 20 миллилитров, добавив достаточное количество BSA в PBS. Теперь добавьте BSA в PBS к коллагеназе и гомогенизируйте раствор, осторожно встряхивая его, прежде чем фильтровать его стерильно через 0,22-микронный нейлоновый сетчатый фильтр.
Немедленно добавьте необходимое количество раствора коллагеназы в суспензию измельченного жира и переварите жир, встряхивая колбу круговыми движениями на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение соответствующего количества времени. Переложите переваренный жир в коническую трубку объемом 50 миллилитров с надписью «Переваренный жир или измельченный жир». Центрифугируйте пробирку при 400 г в течение четырех минут, чтобы микрососудистые фрагменты, или MVF, превратились в красную гранулу.
Аккуратно сцедите надосадочную жидкость в 50-миллилитровую коническую трубку с маркировкой отходов, не нарушая гранулы. Затем добавьте 10 миллилитров одного миллиграмма на миллилитр BSA в PBS в пробирку, содержащую гранулы, и перемешайте суспензию гранул, осторожно пипетируя ее вверх и вниз дважды, не разрушая фрагменты. Теперь возьмите 500-микронный экран, предварительно замоченный в стерильной чашке Петри, содержащей пять миллилитров одного миллиграмма на миллилитр BSA в PBS, и поместите его на пластиковый держатель экрана, хранящийся на новой чашке Петри.
Пипеткой 10 миллилитров суспензии из переваренной грануляторной трубки на сито концентрическими кругами. Промойте фильтр дополнительными пятью миллилитрами по одному миллиграмму на миллилитр BSA в PBS и выбросьте его, сохранив фильтрат внутри чашки Петри. Затем поместите предварительно пропитанный 37-микронный экран над пластиковым держателем экрана на новую чашку Петри.
С помощью свежей пипетки перенесите фильтрат из первой фильтрации на сито концентрическими кругами. Как описано ранее, промойте сито BSA в PBS и на этот раз выбросьте фильтрат, сохранив 37-микронное сито. Вставьте 37-микронный экран в новую чашку Петри, содержащую пять миллилитров одного миллиграмма на миллилитр BSA в PBS.
Удалите фрагменты, осторожно постучав посудой по коническому держателю, не проливая жидкости. Промойте фильтр дополнительными пятью миллилитрами BSA в PBS. Далее перелейте жидкость из чашки Петри в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров.
Промойте 37-микронное сито еще несколько раз, добавляя смывку в коническую трубку, пока общий собранный объем не составит от 15 до 20 миллилитров. Выбросьте экран после окончательного полоскания. Отрежьте конец наконечника пипетки объемом 20 микролитров с помощью ножниц.
Осторожно встряхните пробирку с жидкостью, прежде чем набрать две аликвоты по 20 микролитров с помощью разрезанного наконечника пипетки, и поместите каждую из аликвот в чистую 35-миллиметровую чашку Петри. Подсчитайте количество фрагментов в образце в каждой чашке Петри с помощью стандартного светового микроскопа и, используя формулу, приведенную в рукописи, получите общее количество изолированных микрососудистых фрагментов. Открутите оставшуюся жидкость в 50-миллилитровой конической трубке при 400 G в течение четырех минут, чтобы собрать MVF.
После отжима сцедите большую часть надосадочной жидкости из конической трубки и с помощью пипетки удалите небольшой объем жидкости, оставшийся на ободке трубки. Далее добавляют тромбин в лунки, предназначенные для литья гелей. Отрежьте конец наконечника пипетки объемом 200 микролитров и, используя его, осторожно ресуспендируйте MVF в фибриногене, чтобы получить желаемую конечную плотность.
Пипеткой вводят суспензию в раствор тромбина в лунке и быстро гомогенизируют смесь путем пипетки вверх и вниз. После того, как все гели отлиты, поместите луночную пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа примерно на 15 минут, чтобы обеспечить сшивание геля. Липиды и дифференцированные адипоциты наблюдали с помощью конфокальной микроскопии гидрогелей с использованием BODIPY в качестве липидного окрашивания.
Культивирование неваскуляризированной жировой ткани с использованием белых адипогенных или бежевых адипогенных сред привело к образованию неваскуляризированной белой или бежевой жировой ткани, соответственно, как из худых, так и из диабетических грызунов. Аналогичным образом, культивирование васкуляризированной жировой ткани с использованием белых адипогенных или бежевых адипогенных сред приводило к образованию васкуляризированной белой или бежевой жировой ткани, соответственно, из MVF, полученных от грызунов. Неваскуляризированная белая и бежевая жировая ткань, полученная из MVF человека, также наблюдалась с помощью конфокальной микроскопии.
Способность MVF дифференцироваться в бежевую жировую ткань была генетически подтверждена с помощью ОТ-кПЦР. Худые и диабетические MVF грызунов, подвергшихся воздействию прямых белых адипогенных или бежевых адипогенных сред, оценивали на предмет адипогенеза, термогенеза и ангиогенеза. Экспрессия разъединяющего белка 1, как и ожидалось, была значительно выше в бежевой адипогенной ткани.
Аналогичная тенденция наблюдалась у грызунов, подвергшихся воздействию непрямых белых адипогенных или бежевых адипогенных сред, а также у людей, подвергшихся воздействию прямых белых адипогенных или бежевых адипогенных сред. Наконец, из митохондриальной биоэнергетики было очевидно, что функционально бежевая жировая ткань имела характерно более высокий уровень потребления кислорода, или OCR, во всех случаях. Ферментативное переваривание жировой ткани должно быть оптимизировано для последовательного воспроизведения MVF аналогичного размера и качества.
После переваривания с MVF следует обращаться осторожно, с особой осторожностью, чтобы избежать дальнейшего разрушения фрагментов. Этот метод способствовал дальнейшему балансу роста сосудов и дифференцировки адипоцитов, который, как было доказано, зависел от введенных факторов.
