Este protocolo describe la generación de grasa termogénica vascularizada y funcional tridimensional a partir de fragmentos microvasculares, o MVF. Las estrategias actuales para diseñar tejido adiposo termogénico son complejas y no representan completamente sus propiedades multicelulares y funcionales. Los MVF son una fuente única de células que permiten la vascularización y la formación de tejido adiposo.
Al ser un método simple de fuente única para crear imitaciones biológicas de grasa beige, los MVF tienen un potencial significativo para promover la comprensión o el desarrollo de tratamientos para la obesidad y las enfermedades metabólicas. Coloque el animal debidamente afeitado y sacrificado tratado con etanol al 70% en posición supina y comience el aislamiento de la grasa inguinal. Levante la piel debajo del pene con un par de tijeras y realice la incisión, comenzando en el centro y cortando lateralmente, formando una forma de V, antes de hacer un bucle hacia la parte posterior del animal para acceder a todo el depósito de grasa.
Durante el corte, asegúrese de separar la piel de la grasa cortando el tejido de la fascia interconectado. Una vez que la fascia se corta adecuadamente, asegúrese de que la grasa inguinal de ambos lados, que se extiende desde la ingle hacia la espalda, sea visible. A continuación, retire la grasa de los dos lados en tubos cónicos separados que contienen 10 mililitros de BSA en PBS, que tienen una concentración de un miligramo por mililitro.
Para cosechar la grasa del epidídimo, corte a través de la piel abdominal, seguido de cortar cuidadosamente a través de la capa delgada que rodea los testículos. Tire suavemente del tejido graso con fórceps y córtelo con tijeras, evitando la disección de cualquier vaso sanguíneo visible importante. Ahora, coloque la grasa eliminada en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS.
Para aislar la grasa subcutánea posterior, gire la rata boca abajo y use tijeras grandes para cortar la piel gruesa de la espalda hasta el cuero cabelludo, teniendo cuidado de no cortar demasiado profundo debajo de la piel. Corte la fascia que conecta la piel con el tejido. Diferenciar la grasa subcutánea, ubicada en la región intraescapular, de la grasa marrón ubicada más cerca de la columna vertebral antes de aislar y colocar la grasa subcutánea en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 10 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS.
Mientras trabaja dentro de una biohood, use fórceps para colocar la grasa extirpada en una placa de Petri estándar de 100 mililitros que contenga 0.5 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS. Retire cualquier vaso sanguíneo visible, músculos o tejido extraño de la grasa. Usando tijeras, pica la grasa durante 10 minutos y comprueba si hay grumos agregando un poco más de BSA.
Continuar picando, si es necesario, antes de transferir la suspensión de grasa picada a un matraz estéril de 250 mililitros con una pipeta de 10 mililitros. Haga que el volumen en el matraz sea de hasta 20 mililitros agregando suficiente BSA en PBS. Ahora agregue BSA en PBS a la colagenasa y homogeneice la solución agitándola suavemente antes de filtrarla estéril a través de un filtro de red de nylon de 0.22 micrones.
Agregue inmediatamente la cantidad requerida de solución de colagenasa a la suspensión de grasa picada y digiera la grasa agitando el matraz con movimientos circulares en un baño de agua a 37 grados centígrados durante el tiempo apropiado. Transfiera la grasa digerida a un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como grasa digerida o grasa picada. Centrifugar el tubo a 400 G durante cuatro minutos para hacer girar los fragmentos microvasculares, o MVF, en una bolita roja.
Decantar suavemente el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como desecho sin alterar el pellet. A continuación, agregue 10 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS al tubo que contiene el pellet, y mezcle la suspensión de pellets pipeteándola suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces sin interrumpir los fragmentos. Ahora, tome la pantalla de 500 micras preempapada en una placa de Petri estéril que contiene cinco mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS y colóquela sobre el soporte de pantalla de plástico guardado en una nueva placa de Petri.
Pipetear 10 mililitros de suspensión del tubo de pellets digerido a la pantalla en círculos concéntricos. Lave el filtro con cinco mililitros adicionales de un miligramo por mililitro BSA en PBS y deséchelo, mientras conserva el filtrado dentro de la placa de Petri. Luego coloque la pantalla de 37 micras previamente empapada sobre el soporte de la pantalla de plástico en una nueva placa de Petri.
Con una pipeta nueva, transfiera el filtrado de la primera filtración a la pantalla en círculos concéntricos. Como se describió anteriormente, lave la pantalla con BSA en PBS y, esta vez, deseche el filtrado mientras conserva la pantalla de 37 micras. Deslice la pantalla de 37 micras en una nueva placa de Petri que contenga cinco mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS.
Desaloje los fragmentos golpeando suavemente el plato contra un soporte cónico, sin derramar ningún líquido. Enjuague el filtro con cinco mililitros adicionales de BSA en PBS. A continuación, transfiera el líquido de la placa de Petri a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.
Enjuague la pantalla de 37 micras varias veces más, agregando el lavado al tubo cónico hasta que el volumen total recogido sea de 15 a 20 mililitros. Deseche la pantalla después del enjuague final. Corte el extremo de una punta de pipeta de 20 microlitros con unas tijeras.
Agite suavemente el tubo que contiene el líquido antes de extraer dos alícuotas de 20 microlitros con la punta de la pipeta cortada, y pipete cada una de las alícuotas en una placa de Petri limpia de 35 milímetros. Contar el número de fragmentos en la muestra en cada placa de Petri utilizando un microscopio óptico estándar, y utilizando la fórmula mencionada en el manuscrito, obtener el número total de fragmentos microvasculares aislados. Haga girar el líquido restante en el tubo cónico de 50 mililitros a 400 G durante cuatro minutos para recoger el MVF.
Después de girar, decantar la mayor parte del sobrenadante del tubo cónico y usar una pipeta para eliminar el pequeño volumen de líquido que queda en el borde del tubo. A continuación, agregue trombina en los pocillos designados para geles de fundición. Corte el extremo de una punta de pipeta de 200 microlitros y, con su uso, resuspenda suavemente los MVF en fibrinógeno para obtener la densidad final deseada.
Pipetear la suspensión en la solución de trombina en el pozo y homogeneizar rápidamente la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Una vez que todos los geles estén fundidos, coloque la placa del pozo en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante unos 15 minutos para permitir la reticulación del gel. Los lípidos y los adipocitos diferenciados se observaron mediante microscopía confocal de los hidrogeles utilizando BODIPY como tinción lipídica.
El cultivo de tejido adiposo no vascularizado utilizando medios adipogénicos blancos o adipogénicos beige dio como resultado la formación de tejido adiposo blanco o beige no vascularizado, respectivamente, a partir de MVF derivados de roedores magros y diabéticos. Del mismo modo, el cultivo de tejido adiposo vascularizado utilizando medios adipogénicos blancos o beige dio como resultado la formación de tejido adiposo blanco o beige vascularizado, respectivamente, a partir de los MVF derivados de roedores. El tejido adiposo blanco y beige no vascularizado obtenido de MVF humanos también se observó mediante microscopía confocal.
La capacidad de los MVF para diferenciarse en tejido adiposo beige se confirmó genéticamente mediante RT-qPCR. Se evaluaron los MVF de roedores magros y diabéticos expuestos a medios adipogénicos blancos directos o adipogénicos beige para adipogénesis, termogénesis y angiogénesis. La expresión de la proteína 1 de desacoplamiento como se esperaba, fue significativamente mayor en el tejido adipogénico beige.
Se observó una tendencia similar en los FMM de roedores expuestos a medios adipogénicos blancos indirectos o adipogénicos beige, así como en los FMM humanos expuestos a medios adipogénicos blancos directos o adipogénicos beige. Por último, a partir de la bioenergética mitocondrial, fue evidente que funcionalmente, el tejido adiposo beige tenía una tasa de consumo de oxígeno característicamente más alta, o OCR, en todos los casos. La digestión enzimática del tejido adiposo debe optimizarse para reproducir consistentemente MVF de tamaño y calidad similares.
Después de la digestión, los MVF deben manipularse con cuidado, con especial cuidado para evitar una mayor ruptura de los fragmentos. Esta técnica ayudó a promover el equilibrio del crecimiento de los vasos y la diferenciación de los adipocitos, que ha demostrado ser dependiente de los factores introducidos.
